酶类测定

酶浓度的测定方法 分类： ①相对定量法（酶活性测定法）： 根据酶的催化活性和酶促反应速度测量酶的浓度。目前是临床检验中广泛应用的方法。 　①相对定量法（酶活性测定法）： 　　　根据酶的催化活性和酶促反应速度测量酶的浓度。目前是临床检验中广泛应用的方法。 　 ②绝对定量法： 　　　测定酶蛋白含量或酶分子的浓度。如酶的免疫化学测定法和活性中心滴定法。主要用于酶的研究。

一、基本方法 ㈠选用方法的原则： ①在零级反应期测定，即V＝Vm＝常数，底物减少量[S]或产物生成量[P]与反应时间(t)成正比。 　②反应速度与酶量[E]成线性关系，即 [P] —[S] ＝K [E]＝K t t

㈡酶活性的测定方法： 1.定时法（两点法）： 　　测定酶反应开始后在某一时间内（t1到t2）产物或底物浓度的总变化量来求取酶反应初速度的方法。需终止反应再测定。 2.连续监测法（动力学法或速率法）： 　　连续测定（每15秒～1分钟监测1次）酶反应过程中某一反应物或底物的浓度随时间的变化来求取酶反应初速度的方法。 3.平衡法（终点法）： 　　通过测定酶反应开始至反应达到平衡时产物或底物浓度总变化量来求出酶活力的方法。不需终止反应。　

酶活力的表示法和计算 酶活力的大小以酶单位来表示。 ㈠酶单位： 　　　是反映在某一特定条件下，使酶反应达到某一速度所需要的酶量，而速度是指单位时间(s,min,h)内反应物的变化量(μg,mg, μmol,mol等）。

㈡ 酶单位的表示方法 1.惯用单位： 2.国际单位（IU）： ㈡　酶单位的表示方法 1.惯用单位： 2.国际单位（IU）： 　　　1 IU为在实验规定的条件下（如温度25℃，最适PH，最适底物浓度时）每分钟催化1μmol底物变化所需要的酶量。酶的浓度可用IU/L或IU/ml来表示。　　 3.Kat单位： 　　　在确定的最适反应条件下每秒钟催化1 mol底物变化所需要的酶量为1 Kat单位。 　　1Kat＝60×106IU 　　1IU ＝16.67nKat

㈢酶活力单位的计算 惯用单位的计算： 每单位规定的保温时间 1000ml 产物的增加量 酶单位/升＝ × × 每单位规定的产物的增加量 实际保温时间 以苏氏碘淀粉比色法测定AMY为例： 单位定义：100ml血清中AMY在37℃、30min水解10mg淀粉为1个单位。 底物实际用量浓度（0.4g/l） 底物所用体积（0.5m/l） × AMY活性单位 （U/dl） A空－A测 ＝ × A空 规定产物消耗量（10mg） 规定时间(30min) 规定体积（100ml） × × 实际保温时间（7.5min） 实际标本用量（0.1m/l）

速率法酶活力计算 V总×106 IU/L= △A/min×K K= ε× V标×L △A/min：线性范围内的每分钟吸光度变化 ε：被测物（产物或底物）的摩尔吸光系数 L：比色杯光径（cm） 106：将mol换算成umol

酶样品的贮存与处理 ⑴酶活力测定最常用的样品是血清或血浆，以血清为佳。 ⑵分离血清时应注意避免溶血。 　如：EDTA抑制ALP,草酸盐抑制LDH，肝素对CK及某些其它的酶有轻微的抑制作用。 ⑵分离血清时应注意避免溶血。 　多数血清酶以较高浓度存在于红细胞、白细胞或血小板中。 ⑶测定CK的血清应贮存于4℃的暗处，测定时应该注意避光。 ⑷由于血清白蛋白对酶蛋白有稳定作用，在它的存在下，某些酶（如转氨酶）在室温下可保存1～2天而无明显失活。 ⑸有些酶由于自身的特性，在贮存时需特别加以注意。如LDH的“冷变性”。 ⑹由于酶很容易发生表面变性，因此在操作时应避免形成泡沫。 ⑺在酶的活性测定、抽提、制备及保存中，常可添加-SH保护剂，如半胱氨酸、谷胱甘肽、2－巯基乙醇、二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇等。巯基（-SH）对于大多数酶来说是十分重要的，使巯基保持天然状态是使许多酶稳定化的最重要条件之一。

酶活性测定方法的标准化和质量控制 标准化的方法：一般认为应用速率法 ⒈酶活性测定所用的标准品 　⒈酶活性测定所用的标准品 　⒉酶活性测定的条件标准化，即建立标准化的酶活性测定方法。 质量控制：难度较大。 　　适合于其它血清成分测定的质量控制方法，原则上也可用于酶活性测定的质量控制。

同工酶测定 同工酶的定义： 　　　催化功能相同，但是分子组成及理化性质不同的一组酶。是在同一种属中由不同基因位点或等位基因编码的多肽链单体、纯聚物或杂合体。 特点： 　　　在体内往往呈组织器官区域化分布或细胞内区域化分布，具有组织特异性。

同工酶产生的机理 由不同基因位点编码：如LDH的H、M亚基 由等位基因编码 由多肽链化学修饰产生：如ALP同工酶

同工酶的测定方法 （一）按理化性质不同进行分离鉴定 1.电泳法 2.层析法：离子交换层析、亲合层析 　　1.电泳法 　　2.层析法：离子交换层析、亲合层析 （二）按底物专一性不同进行鉴定：Km值不同 （三）按最适PH不同进行鉴定： （四）按免疫学特性不同进行分离鉴定 （五）按耐热程度不同进行鉴定： 　　　如：ALP同工酶中ALP-4耐56℃ 　　　　　LDH同工酶中LDH1耐60℃ （六）选择性抑制法： 如：ACP同工酶中前列腺ACP受L-酒石酸抑制，其余不受抑制。

酶活性测定最适条件的选择 一、标本：是影响酶活性测定的首要因素 二、测定条件： 1.[S]：一般选10～20Km为宜 　2.[E]：要求[S] ﹥﹥[E] 　3.温度： 　　　多数酶最适温度为37～40℃，测定要恒温，波动在±1 ℃内。 　4.PH： 　　　多数酶的最适PH在5～8间，要求缓冲液有足　够的缓冲容量。 　5.辅助因子： 　6.激活剂： 　7.避免抑制剂