Chapter 2 细胞生物学研究方法

纲 要 ☆ 2.1 显微成像技术 2.2 细胞化学技术 2.3 细胞分选技术 2.4 细胞工程技术 2.5 分离技术 2.6 分子生物学方法

2.1 显微成像技术 2.1.1 光学显微镜 焦距(focal length)：是透镜的中心平面到焦点的距离 。

角孔径(angular aperture)：是光从样品进入显微镜的物镜半角α，因此角孔径实际表示有多少光离开样品通过透镜， 最好的光学显微镜的角孔径大约是70度。

分辨率(resolution, r) ：显微镜或人眼在25 cm明视距离处，能清楚分辨被检物体细微结构最小间隔的能力 。 r=0.61λ/ n sinα 其中：n=聚光镜和物镜之间介质的折射率, 空气为1, 油为1.5; 　　　α=样品对物镜角孔径的半角 　　　λ=照明光源的波长。 　　　0.61是一个恒定的参数 r值越小，分辨能力越高。 波长越短，分辨能力越高。

波长与分辨率

分辨极限(limit resolution) ●一般地说，一定波长的射线不能用以探查比它本身波长短得多的结构细节，这是一切显微镜的一个基本限度。 ●对可见光（0.4～0.7 μm ）来说，能清楚地分辨出相邻两点之间的最小间隔是0.2 μm。 放大率(magnification) ●最终成像的大小与原物体大小的比值称为放大率。

◆普通双筒显微镜 (binocular microscope) 2.1.2 常用光学显微镜 ◆普通双筒显微镜 (binocular microscope) ◆荧光显微镜 (fluorescence microscope) ◆相差显微镜 (phase contrast microscope) ◆暗视野显微镜(dark field microscope) ◆倒置显微镜(inverted microscope)

普通光学显微镜

荧光显微镜(fluorescence microscope) 荧光显微镜以紫外线为光源照射被检物体， 使之 发出荧光，然后在显微镜下观察物体的形态及其 所在位置。 要求：被检物体发荧光（自发荧光、诱发荧光） 用途：用于研究细胞内物质的吸收、运输及化学物质的分布和定位等。

荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色） 图片来自http://www.itg.uiuc.edu/

Laser scanning confocal microscope

相差显微镜(phase contrast microscope) 优点：能够观察无色、透明、活细胞中的结构。 特点：能将物体本身的相位差（光程差）转换为振幅（光强度）变化的显微镜。

实验原理 波长(颜色) 振幅(亮度) 相差(看不见的) 相差显微镜的环状光栏和相板(phase plate)能使活细胞或末经染色的标本中各部分的折射率或厚度的微小差异，产生相位差，然后利用光的衍射和干涉的原理，把相差变成振幅(明暗)之差，使人的肉眼能够辨认出来。

相板 环状光阑

暗视野显微镜(dark field microscope) 利用特殊的聚光器使照明光线不能进入物镜被放大，在黑暗的背景下呈现明亮的像。这种特殊的照明方式，使反差增大，分辨率提高。 用途：用以观察未经染色的活体或胶体粒子。 特点：主要观察的是物体的轮廓，分辨不清内部的微细结构。

倒置显微镜(inverted microscope) 物镜与照明系统的位置颠倒过来。 物镜置于载物台之下， 光源位于载物台的上方。 集光器与载物台之间的工作距离提高， 可以放置培养皿、培养瓶等容器， 直接对培养的细胞进行照明和观察。

2.1.3 光学显微镜的样品制备 1. 样品的固定(fixation) ● 目的: ● 做法: ●固定液： 快速杀死细胞，稳定细胞的化学成份，并且使样品硬化以便在进一步的处理和切片时不会受到破坏。 将样品浸泡在固定液中。固定使得大分子交联而保持在一定的位置上，不致于在以后的染色等处理过程中移位或丢失而产生人工假象。 一般用具有缓冲作用的醛类固定液，用甲醛或戊二醛作固定剂，能够与蛋白质的游离氨基形成共价键，从而将邻近的蛋白质分子牢固地交联在一起。  

2. 包埋和切片(embedding and sectioning) 包埋：通常用液态的石蜡或树脂做包埋剂，使之渗入整块组织，使之硬化成固体的包埋块。 切片机切割包埋块，制备成薄切片。适用于光学显微镜观察的切片厚度为 l～10 μm。

3. 染色(staining) 目的：给细胞的不同组分带上可区别的颜色特征。 苏木精(hematoxylin)：核酸 伊红(eosin)：细胞质 苏丹染料(Sudan dyes)：脂肪

4. 放射自显影 用感光胶片测定细胞内某种被放射性标记的物质在细胞固定时所在的位置。

2.1.4 电子显微镜(electron microscope) 1. 透射电子显微镜(transmission electron microscope，TEM) 让电子束穿透样片而成像。

Transmission Electron Microscope

2. 扫描电子显微镜(scanning electron microscopy，SEM) 用二次电子成像来观察样品的表面结构。

Scanning Electron Microscope

Lymphocyte viewed through a TEM and a SEM Lymphocyte viewed through a TEM and a SEM. (a) This TEM shows a thin slice of a lymphocyte, a type of white blood cell. This type of microscopy allows one to see the internal structures present in the slice. (b) In a SEM, surface structures can be seen ,as demonstrated in this view of a lymphocyte.Note the three-dimensional appearance of this cell,in contrast to the two-dimensional appearance of the cell in(a)

2.1.5 电子显微镜的样品制备 与光镜相比，组织固定的特殊要求： 样品要薄，制成50～100nm的超薄切片。 保持样品的精细结构。 样品要具有一定的反差。 电子显微镜的样品切片最后被放置在载网上而不是玻片上。

染色(Stainning) 醋酸双氧铀： 可与细胞内大多数分子结合，染核酸和蛋白质，但对膜的染色效果较差。 柠檬酸铅：核蛋白及糖元结合，也可大大提高细胞膜系统与物质的反差。

1.负染色(negative stainning) 用重金属作染色剂，对铺展在载网上的样品进行染色，使整个载网都铺上一层重金属盐，而有凸出颗粒的地方则没有染料沉积。由于电子密度高的重金属盐包埋了样品中低电子密度的背景，增强了背景散射电子的能力以提高反差。这样，在图像中背景是黑暗的，而未包埋的样品颗粒则透明光亮，这种染色称为负染色。

2. 喷镀技术 是电子显微镜中一种重要的增强背景和待观察样品反差的方法。

3.冰冻蚀刻技术

利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化 电镜与光镜的比较 显微镜 分辨本领 光源 透镜 真空 成像原理 LM TEM 200nm 100nm 0.1nm 可见光（400-700） 紫外光 （约200nm) 电子束 （0.01-0.9） 玻璃透镜 石英透镜 电磁透镜 不要求真空 要求真空 1.33x10-5～1.33x10-3Pa 利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化 利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差

显微结构（microscopic structure）：光镜下所见到的物体结构。 超微结构（ultrastructure）:又称为亚显微结构。是在光学显微镜下观察不到而只能在电子显微镜下观察的结构。

2.2 细胞化学技术 ◆ 酶细胞化学技术：通过酶的特异细胞化学反应来显示酶在细胞内的定位。 ◆ 免疫细胞化学技术：利用免疫反应定位组织或细胞中抗原成分分布的一类技术。 免疫荧光技术 免疫电镜

Figure 9-16. Indirect immuno-cytochemistry Figure 9-16. Indirect immuno-cytochemistry. This detection method is very sensitive because the primary antibody is itself recognized by many molecules of the secondary antibody. The secondary antibody is covalently coupled to a marker molecule that makes it readily detectable. Commonly used marker molecules include fluorescent dyes (for fluorescence microscopy), the enzyme horseradish peroxidase (for either conventional light microscopy or electron microscopy), colloidal gold spheres (for electron microscopy), and the enzymes alkaline phosphatase or peroxidase (for biochemical detection).

过氧化氢酶 过氧物酶体

2.3 细胞分选技术(cell sorting) ◆细胞分选： 用流式细胞仪（flow cytometer， FCM）对细胞或染色体进行分选，并进行定量分析。

细胞标记

超声波振荡器 流式细胞术 干涉 荧光 非荧光标记细胞收集器 荧光标记细胞收集器 无细胞液滴收集器

染色体标记

染色体分选 流式细胞仪

2.4 细胞工程技术 ◆细胞工程：应用细胞生物学的原理和方法，结合工程学的技术手段，按照人们的设计，改变细胞内遗传物质以获得新型生物或特种细胞的一门综合性科学技术。 ◆细胞培养：在体外模拟体内的生理环境，培养从机体中取出的细胞，并使之生存和生长的技术。 正常细胞一般可培养40～50代。

◆细胞融合(cell fusion) 指自发或人工诱导下，两个不同基因型的细胞或原生质体融合形成一个杂种细胞。 灭活的仙台病毒 或聚乙二醇

◆单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique) HAT培养基包含： 次黄嘌呤（H） 胸腺嘧啶（T） 氨基蝶呤（A）

◆ 显微操作术(micromanipulation) 用显微操作装置对细胞进行解剖手术和微量注射的技术 。

◆ 动物细胞核移植克隆技术 A B C D

一、名词解释 分辨率、显微结构、超微结构 二、简要说明电子显微镜和光学显微镜的主要区别 三、光学显微镜（ 荧光显微镜 、相差显微镜、暗视野显微镜、倒置显微镜）和电子显微镜（扫描电子显微镜和透射电子显微镜）的原理与应用范围。