TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD “从RNA提取到荧光定量PCR”解决方案 ―RT系统 TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD 大家好，我天根生化公司负责RNA及病毒研究专项的产品负责人，我叫周波，很高兴今天能在这里和大家共同讨论在RNA和病毒研究中关于核酸纯化方面的一些问题。 过渡词：各位老师都知道，RNA中的信使RNA是遗传信息的载体，提取RNA是分子生物学最基本的一项技术，但是因为RNA非常容易降解，这就增加了提取的难度。
RT-PCR原理简介 RT-PCR技术中的关键点 TIANGEN公司RT产品选择指南
RT-PCR原理简介 RNA cDNA 目的 片段 PCR RT
cDNA第一链合成法示意图（两步法）
一步法实验示意图（同一个反应管中）
RT-PCR两种方法 适用于mRNA表达量解析 适用于病毒、病原菌检测 Two Step RT-PCR效率高 cDNA分装 One Step RT-PCR 适用于mRNA表达量解析 Two Step RT-PCR效率高 使用Random和Oligo-dT 引物可以制备cDNA pool cDNA可长期保存 适用于病毒、病原菌检测 操作简单 污染几率低
RT引物的选择 目的片段在mRNA任何位置都能使用。通常mRNA表达量分析最适。 5’ 3’ 1,500base 2,000base Random 6mer 1,500base 目的片段 5’ 3’ R F Gene specific Primer AAA···A 2,000base Oligo dT Primer 目的片段在mRNA任何位置都能使用。通常mRNA表达量分析最适。 目的片段在距Poly(A) Tail 2kbp以内适用。 One Step RT-PCR只能使用Gene specific Primer， 不适用于mRNA表达量分析等复数基因的检出。
RT-PCR原理简介 RT-PCR技术中的关键点 TIANGEN公司RT产品选择指南
RT反应体系 模板：总RNA，mRNA，体外转录的RNA 引物：随机引物，Oligo dT，基因特异性引物(GSP) 反转录酶：AMV M-MLV Quant Reverse Transcriptase
逆转录酶的选择 AMV：禽成髓细胞瘤病毒，逆转录酶和RNA酶H活性。最适42℃。 MMLV：Moloney 鼠白血病病毒，逆转录酶，RNA酶H活性较弱。最 适37℃或42℃。 Quant Reverse Transcriptase 全新高效逆转录酶，与RNA模板的亲和力强， 对GC含量高的模板通 读效果好，质量稳定，最适37℃。
RNase H的作用 水解RNA-DNA杂合链中的RNA
RT实验要素－决定反应的特异性及灵敏性 分离高质量RNA 使用高活性的逆转录酶 提高逆转录酶保温温度 减少基因组DNA污染
问题1：RT-PCR没有产物 对 策 原因 分离无污染、高质量的RNA，用0.1－0.5μg乙酰BSA增加RNA的量 RNA降解或起始量少 确定退火温度适合实验中所用的引物 PCR步骤中cDNA模板不能超过反应体积的1/5 尝试其它组织 RNA降解或起始量少 RNA提取后含抑制成分 cDNA合成时引物退火 不充分 PCR失败 目的基因在组织中不 表达或表达量低 对 策
问题2：非特异性扩增
非特异性扩增 对 策 原因 用扩增级DNase1处理RNA,使用抗气雾剂的吸头 cDNA合成中使用基因特异性引物，使用递减PCR RNA中有内源或外源DNA污染 引物和模板非特异性退火 基因特异性引物设计较差 形成引物二聚体 镁离子浓度太高 原因 对 策 用扩增级DNase1处理RNA,使用抗气雾剂的吸头 cDNA合成中使用基因特异性引物，使用递减PCR 遵循用于扩增引物设计的同样原则 设计在3’端没有互补序列的引物 优化镁离子浓度
问题3：弥散
弥 散 对 策 原因 常规PCR步骤中减少模板cDNA的量 cDNA第一链产物的含量过高 提取高质量RNA，防止被DNA污染 减少引物的用量 优化PCR反应条件，减少PCR的循环次数 提高退火温度，防止非特异性的起始及延伸 cDNA第一链产物的含量过高 DNase降解DNA产生的寡核苷酸的非特异性扩增 PCR反应中引物过多 循环数过多 退火温度过低 对 策
RT-PCR原理简介 RT-PCR技术中的关键点 TIANGEN公司RT产品选择指南
TIANGEN公司RT产品系列 目录号 产品名称 包装 价格（元） ER103-02/03/04 Quant Reverse Transcriptase 25/50/100次 850/1500/2800 KR103-03/04 Quant cDNA第一链合成试剂盒 25/100次 1000/3000 KR113 Quant一步法RT-PCR试剂盒 50次 1400 ER104-03/04 TIANScript M-MLV 5000/20000U 250/850 KR104 TIANScript cDNA第一链合成试剂盒 400/1380
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