报告人：张庆 导 师：玉柱 教授 中国农业大学草业科学系 羊草青贮饲料专用乳酸菌的筛选和应用 报告人：张庆 导 师：玉柱 教授 中国农业大学草业科学系

主要研究思路 乳酸菌菌群结构 乳酸菌分离、鉴定 发酵品质 微生物菌群 有氧稳定性 体外消化 优质乳酸菌

主要内容 研究意义 乳酸菌菌群结构 乳酸菌的分离、鉴定和筛选 乳酸菌的应用 乳酸菌的改造

1.研究意义 羊草青贮困难：羊草本身特点，其他（天气、机械等） 孕穗期和抽穗期刈割羊草的化学和微生物组成 孕穗期 抽穗期 干物质(g kg-1) 365.6 ± 3.02 398.4 ± 7.30 中性洗涤纤维(g kg-1 DM) 532.9 ± 10.65 610.9 ± 11.04 酸性洗涤纤维(g kg-1 DM) 272.6 ± 6.10 283.7 ± 5.73 酸性洗涤木质素(g kg-1 DM) 39.5 ± 2.03 54.1 ± 3.18 粗蛋白(g kg-1 DM) 128.3 ± 5.76 94.3 ± 0.05 可溶性糖(g kg-1 DM) 46.9 ± 1.56 35.6 ± 4.56 干物质体外消化率(g kg-1 DM) 597.7 ± 11.58 558.5 ± 11.41 乳酸菌(log cfu g-1FM) 2.8 ± 0.08 4.8 ± 0.07 酵母菌 和酵母菌(log cfu g-1FM) 3.0 ± 0.03 3.4 ± 0.55 大肠菌(log cfu g-1FM) 4.9 ± 0.01 6.0 ± 0.04

Zhang et al. 2015. Animal Science Journal 2.乳酸菌的菌群结构 A B C D E F 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Uncultured bacterium Lactobacillus rhamnosus Enterococcus faecalis Lactobacillus plantarum Serratia sp. Serratia sp. 羊草青贮饲料中微生物的DGGE图谱 Zhang et al. 2015. Animal Science Journal

3.乳酸菌的分离、鉴定和筛选

羊草青贮饲料中提取乳酸菌的进化树

羊草青贮饲料中提取的乳酸菌菌株及NCBI接收号 种属 NCBI接收号 NG1 Lactobacillus brevis KR107058 NG2 Lactobacillus plantarum KR107059 NG3 KR107060 NG4 KR107061 NG5 Lactobacillus casei KR107062 NG6 Weissella paramesenteroides KR107063 NG7 Enterococcus faecium KR107064 NG8 Enterococcus faecalis KR107065 NG9 Enterococcus mundtii KR107068 NG10 Enterococcus sulfureus KR107066 NG11 Lactococcus garvieae KR107067 NG12 Enterococcus durans KR107069

羊草青贮饲料中乳酸菌的种类及比例（167株）

小结 羊草青贮饲料中乳酸菌种类丰富, 以肠球菌（Enterococcus faecalis和Enterococcus faecium）和乳杆菌（Lactobacillus plantarum和Lactobacillus brevis）为主； 获得生长快产酸高的乳酸菌, LP, LPL1, LPL2, LPL3, LC, LCL, LB, WH, 经鉴定分别属于Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei, Lactobacillus brevis, Weissella hellenica。

4.乳酸菌的应用

4.1乳酸菌对羊草青贮饲料发酵品质及有氧稳定性的影响 乳酸菌添加剂和青贮密度对羊草青贮pH值的影响

乳酸菌添加剂和青贮密度对羊草青贮乳酸含量（%DM）的影响 Zhang et al. 2015 乳酸菌添加剂和青贮密度对羊草青贮乳酸含量（%DM）的影响 Zhang et al. 2015. Letter in Applied Microbiology

乳酸菌添加剂对羊草青贮有氧稳定性的影响 Zhang et al. 2015. Grass and Forage Science

小结 LB, LPL1, LPL2, LPL3, LCL，WH提高了羊草青贮饲料的发酵品质； 羊草在较高密度条件（600kg/m3）下，青贮品质更好； 在较低密度条件（500kg/m3）下添加乳酸菌同样可以获得好的青贮品质； 除LCL外，这几种乳酸菌添加剂均显著提高羊草青贮饲料的有氧稳定性。

4.2乳酸菌对羊草青贮饲料发酵品质及消化性的影响 pH 乳酸(%DM) 氨态氮(%TN) 丁酸(%DM)

收获时期和乳酸菌添加剂对羊草青贮品质和体外消化率的影响 Zhang et al. 2015. Grass and Forage Science

小结 羊草在孕穗期收获比在抽穗期收获青贮品质更好； 在较晚时期（抽穗期）收获，添加乳酸菌同样可以获得好的青贮品质； LP和LC提高了羊草青贮饲料的发酵品质；对羊草体外消化率没有显著作用。

5.乳酸菌的改造 构建乳酸菌工程菌 设计方案 目的基因：木质素酶Xylanases (b-1,4-Endoxylanases, EC 3.2.1.8)基因, 681bp (嗜热拟青霉) 质粒：穿梭质粒pMG36e，红霉素抗性，P32启动子 限制性内切酶：XbaⅠ，Hind Ⅲ   木质素酶基因 重组质粒 pMG36e ＋ LP、LC 工程菌

M 质粒 5000bp 质粒pMG36e M X H X+H 750bp 目的基因酶切

M 空白 目的基因片段 750bp 目的基因成功转入大肠菌

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