半保留模型（semioconservetive model） 全保留复制模型(conservetive model) 第三章 DNA的复制 第一节 半保留复制的验证 半保留模型（semioconservetive model） 全保留复制模型(conservetive model) 分散模型(Dispersive model)。

验证半保留复制的实验 一、Meselson-Stahl实验 二、Taylar实验 三、姐妹染色单体差别染色方法（sister- chromatid differential staining） 5溴脱氧尿嘧啶（5-Bromodeoxy uridine，简称BUdR） 斑色染色体（Harlequin chromosome） 四、Cairns复制模型—θ型复制

图11-4 Taylor 蚕豆根尖放射自显影实验。 (a)按半保留复制预期DNA在复制过程中标记情况；(b)实验结果染色体放射自显影的图示。

第二节 复制的起点、方向和终点 一. 研究方法： 1. 用同位素标记电镜观察及变性法 2. 用噬菌体插入标记法 同步培养 不同步培养 第二节 复制的起点、方向和终点 一. 研究方法： 1. 用同位素标记电镜观察及变性法 2. 用噬菌体插入标记法 同步培养 不同步培养 3. 变性定性法（denaturation mapping） 4. 双向电泳法

图11-11不同步培养时各标记的拷贝数不同 复制起点标记的拷贝数应最多 图11-11不同步培养时各标记的拷贝数不同 复制起点标记的拷贝数应最多

二、原核的复制起点和方向 E.coli定点、双向对称复制。 T7在近一端的17％处开始，向两端延伸。 枯草杆菌有固定的起始点，双向不对称复制。 质粒R6K早期为单向复制，复制了约1/5基因组 进行时双向复制。 质粒Col E1有固定起始点，但却为单向复制。 mt DNA进行D（displaced loop）环复制  真核有多个复制起点（i），双向等速复制。

D环复制

第三节 DNA复制突变型的筛选 根据温度敏感性筛选 同位素标记法筛选 5－溴尿嘧啶掺入法 质粒温度敏感性的筛选 根据抗药性筛选 根据与突变有关的生物学功能筛选 快停突变与慢停突变

第四节 原核生物复制的酶系统 DNA合成酶 DNA聚合酶的共同特点是： （1）需要提供合成模板； 第四节 原核生物复制的酶系统 DNA合成酶 DNA聚合酶的共同特点是： （1）需要提供合成模板； （2）不能起始新的DNA链，必须要有引物提供3'－OH； （3）合成的方向都是5’→3’; （4）除聚合DNA外还有其它功能。

表11-1 E.coli 中的三种DNA多聚酶 DNApolⅠ DNApol Ⅱ DNA pol Ⅲ 结构 分子量 90 KD 900 KD   DNApolⅠ DNApol Ⅱ DNA pol Ⅲ 结构 分子量 109 KD 90 KD 900 KD 构成 单体 异多聚体 分子数/细胞 400 ？ 10-20 酶活性： 5 →3`聚合酶 + 3`→5`外切酶 5`→3`外切酶 － －(可切单链) 突变体 突变位点 pol A pol B polC(dnaE), dnaN, dnaZX, dnaQ, dnaT 突变表型 修复有缺陷 能修复 阻止复制    

(一). DNA聚合酶I的结构 DNA聚合酶有6个结合位点： (1) 模板结合位点； (2) 引物结合位点； (1) 模板结合位点； (2) 引物结合位点； (3) 引物3’－OH结合位点； (4) 底物dNTP结合位点； (5) 5’→3’外切酶结合位点； (6) 3’→5’校正位点。

(二). DNA聚合酶Ⅰ的功能 1. 5’→3’聚合功能 2. 3’→5’外切活性 3. 5’→3’外切活性 1. 5’→3’聚合功能 2. 3’→5’外切活性 3. 5’→3’外切活性 (1)切口平移（nick translation）； (2)链的置换； (3)模板转换（template-switching） 4. 内切酶活性

(三)DNA多聚酶Ⅲ的结构

全酶在DNA上的装配分为三个阶段： （1）一个β二聚体加上一个γ复合体识别引物模板形成一种前起始复合物。 （2）DNA在于β,γ复合体结合的位点构象发生改变，而对核心酶产生了高亲和。使核心酶能与DNA结合。 （3）τ二聚体结合核心聚合酶，使其二聚化。

二. DNA连接酶 其作用机制是分三步进行： 1. 在真核生物中， E＋ATP→E－AMP＋ppi 在E.coli中， E＋NAD→E－AMP＋NMN（烟酰胺单核苷酸） 2. E-AMP上的AMP转移到DNA的5’-PO4上使其活化 3. 活化的5’－PO4与相邻的3’－OH作用形成 3’－5’磷酸二酯键，并释放出AMP。

三. 单链结合蛋白（SSB） 又称为双螺旋去稳定蛋白（helix destabilizing protein） 由177个aa组成 在E.coli 中以四聚存在 分子量为74KDa 在原核中SSB与DNA结合表现出协同效应。 （1）SSB之间的相互作用； （2）第一个SSB和DNA的结合改变了DNA的结构。

四.解旋酶(helicase)

第五节 原核生物，噬菌体和病毒的复制 起始和终止 第五节 原核生物，噬菌体和病毒的复制 起始和终止 一.环状DNA的复制

复制起始区的结构特点是： （1）富含A－T，这可能和双链易于解开起始 复制有关； （2）含有多个回文结构（9－14个GATC） 8个GATC较保守,CATC中的“ A”已甲基化; （3）具有 4个反向重复顺序，作为蛋白结合 位点； （4）此顺序的右侧毗邻区域有两个启动子，其可能的作用是：①转录产生引物；②产生复制必要的蛋白；③产生调节功能的RNA；④起转录激活作用。

1968年Gilbert提出滚环复制模型: （1）共价延伸； （2）模板链和新合成的链 分开; （3）不需RNA引物，在正 链3‘－OH上延伸 （4）只有一个复制叉; （5）形成多联体（concatemer ）;

滚环复制的电镜照片

哪些DNA进行滚环复制? 真核rDNA的扩增； F因子DNA的转移； λ裂解途经的复制； φX174,M13.G4等；

二.DNA末端起始复制 线性双链DNA的复制有的是从一端开始的: 腺病毒（Adenovirus） φ29 DNAs 脊髓灰质病毒（poliovirus) 腺病毒DNA全长35937 bp，线性双链， 两端各有反向重复顺序103～162 bp，两末端各有50 bp为复制起点。 其复制是以单链置换（strand displacement）形成一个大的茎环或叫平锅形结构来进行的。

三.复制的终止 E.coli的复制终止 现已发现有两个终止区域（terE,D,A和ter C,B），位于相遇点的另一侧100Kb处。每一终止顺序对某一方向移动的复制叉来说是特异的。 ter顺序有一个23bp的区域，在体外可导致复制的终止，但其功能显示了一定的方向性。 终止需要tus(terminus utilization substance)基因的产物Tus(36kD)，Tus能识别ter保守顺序，并阻止复制叉继续前进。 ter-Tus复合物可能通过抑制螺旋酶来实行终止。

第六节 复制的过程 一.半不连续复制

E.colidUTPase，它能使dUTP变成dUMP，dUMP是不能作为DNA合成的底物，这样它就不再能加入DNA中。 尿嘧啶N-糖苷酶（uracil N-glycosylase），它可以切断混合尿苷的糖苷键，形成无Pu和Py位点（apurinic or apyrimidinic ，AP），再由AP内切酶在AP位点切出一个缺口，进一步进行切除修复。

以下实验证实了这个解释： (1)在dut -突变体（dUTPase缺失）中冈崎片段比在dut +中为短。这是因为U掺入机会增加； (2)在ung- （尿嘧啶N-糖苷酶缺失）突变体中，新合成的DNA约有一半由片段组成。 (3)因为尿嘧啶N-糖苷酶缺失，不会切除U的糖苷链，也就不会出现AP位点，所以碱沉淀时不易断裂，从而保持了半不连续的原貌。 在dut-, ung-双突变体中，结果和实验（2）相同，更进一步证实了此推测。

酵母的自主复制区 ARS(autonomously replicationg sequence) 发挥复制起点的功能，但是过量的； ARS1分为A,B,C三个功能区, A,B起主要作用,C起次要作用； A区为15bp,其中11个保守，称ACS (ARS consensus sequence)。有复制起始子的功能； B区约为80bp,含B1,B2,B3三个功能区； B3是ABF1（ARS-binding factor 1）结合区。

酵母的复制

ORC：由6个亚基组成相当于DnaA和λ的O蛋白，与 A/B1结合，结合于游离的DNA Cdc6:相当于DnaC,及λ的P蛋白，使Mcm蛋白结合到复合体上。此对在Origin上起始复制是必须的。 Mcm: DnaB 螺旋酶。即 licensing factor ABF1（转录因子）结合于B3

原核和真核生物复制体系的比较 E.coli λ SV40/人 酵母 功能 DnaA O T抗原 ORC 起始蛋白 DnaB DnaB T抗原 MCM 解旋酶 DnaC P ? Cdc6 装配因子 DnaG DnaG Polα-引发酶 Polα-引发酶 引发酶 PolⅢ的 α亚基 Polδ Polδ,Polε 聚合酶 PolⅢ的ε亚基 Polδ Polδ,Polε 校正 PolⅢ的亚基 PCNA PCNA 滑动钳  复合体 RF-C RF-C 滑动钳装配器 SSB RF-A RF-A 单链结合蛋白

Pvu Pvu 转化酵母 Pvu Bg1 Bam H1 Bam pBR322 TEL TEL 四膜虫rDNA ARS 连接 Pvu 转化酵母 Pvu 传几代 酵母DNA Pvu Pvu 转化酵母 传几代 图 11-56 四膜虫与酵母TEL的拼接以及酵母细胞将其特有的TEL加到四膜虫 的TEL上(参考Shampg,J and Blackburn et al: 《Nature》1984,310:154-157)

真核生物与原核生物DNA合成的区别

真核DNA复制和原核DNA复制的区别 1、 真核DNA复制为多个复制起点。 2 、真核DNA复制时DNA聚合酶有五种（α、β、γ、δ和ε），其中只有δ酶具有3′→5′外切酶活性；而原核生物只有三种DNA聚合酶（polⅠ、Ⅱ、Ⅲ），且都具有3′→5′外切酶活性。真核的polδ和α分别负责合成前导链和后滞链，而原核的polⅢ是两者兼顾。 3、真核细胞内DNA引物酶和polα紧密偶联，而在原核细胞内引发酶是和解旋酶偶联在一起，形成复制体的一部分。

作业： 1、图示说明DNA半保留复制的机制证明。 2、DNA复制为何选择RNA作为引物？ 3、试比较原核与真核生物DNA复制的异同。