综合性、设计性实验内容 —— 热激诱导的玉米幼苗耐热性观 及其生理生化机制研究 综合性、设计性实验内容 —— 热激诱导的玉米幼苗耐热性观 及其生理生化机制研究

第一部分 实验背景

Mechanical stimulation Biotic stress

Braam 2005 Wind Rain Mechanical stimulation Wound Touch 返回

Biotic stress 返回

Yahraus1995 Ca2+ Haley 1995 NO H2O2 Garces 2001

Borsics 2001 Polisensky 1996 Braam 1992

植物细胞中ROS产生途径 Oxalate oxidase ⑦ ① ② ③ ⑤ ⑥ ④

Decomposation CAT APX GR

氧化还原平衡

10~40% 60~90%

1nS 4mS 2mS OH. O2.- 1O2 1mS~min H2O2

第二部分　植物材料的培养、热激和热处理

植物材料的培养 　品种为晴3或鲁玉13的玉米种子（购于西山种子公司）→ 用0.1% HgCl2消毒10 min后 → 用蒸馏水漂洗干净 → 用蒸馏水于26℃下吸涨12 h → 播于垫有6层湿润滤纸的带盖白磁盘（24cm×16cm）中 → 于26℃下暗萌发60 h →计算发芽率 → 选取长势一致的玉米幼苗做以下处理（去除较矮或较高的玉米幼苗）。 热激 　把上述玉米幼苗经42℃热激处理4 h并于26℃恢复培养4 h后。对照组（未热激）玉米幼苗仍在26℃下继续培养8 h。

热处理 伤害率和存活率测定 恢复后，然后把经热激和未热激的玉米幼苗转入47℃下高温处理14~17 h（白磁盘加盖）。 　处理结束后，先观察伤害率（胚芽鞘明显变褐），在把玉米幼苗转到26℃下恢复培养7d，每天光照12 h，然后计算存活率（以恢复培养过程中能够转绿并恢复生长的玉米幼苗视为存活的幼苗）。

第三部分　　生理指标的测定

一、热激诱导的玉米幼苗耐热性部分 生理指标的测定 伤害率 存活率 组织还原力（ＴＴＣ还原力） 膜伤害----丙二醛（ＭＤＡ）含量 直接观察统计

Drought Heavy metal Salt Heat

532nm 440nm 返回

１、伤害率的测定 返回

２、存活率的测定 返回

植物组织活力测定方法参考文献

３、组织活力的测定 原理 　有活力的植物组织由于呼吸作用的存在，底物脱下来的Ｈ＋可以形成NADH2或NADPH2,无色的TTC（红四氮唑）可以被前者还原为红色的TTF（三苯基甲潜），其最大光吸收为485 nm。 测定：分别取48℃高温处理17 h 实验组和对照组的胚芽鞘0.２g →加入5 ml 0.6% TTC溶液（用50 mmol/L PBS,pH7.0配制）→抽气使TTC渗入组织→27℃,15 h →去除TTC溶液→着色的胚芽鞘加入少许石英砂和95%乙醇→充分研磨提取TTF→80℃水浴10 min → 冷却后定容到25 ml →测定OD485 →用OD485.g-1FW表示组织活力。返回

MDA含量测定方法参考文献

在酸性条件下MDA与硫代巴比妥酸（TBA）反应生成粉红色化合物，此化合物在532 nm处有最高吸收峰，ε=155 mM-1.cm-1。 原理 　植物在遇到干旱、高温、低温、盐渍以及衰老等情况下，植物体内H2O2、O2.-、OH.等活性氧(reactive oxygen species, ROS)大量积累（返回），导致膜脂过氧化而积累MDA,因此MDA常作为植物逆境伤害指标。 在酸性条件下MDA与硫代巴比妥酸（TBA）反应生成粉红色化合物，此化合物在532 nm处有最高吸收峰，ε=155 mM-1.cm-1。

MDA提取：分别取0.5 g实验组和对照组的胚芽鞘→加入3 mL 5%三氯乙酸（TCA）和少许石英砂→充分研磨→用2 mL 5% TCA洗研钵→5000 rpm离心10 min →上清液定容至10 mL。 测定：分别取上清液各2 mL →加入0.6%TBA（用20% TCA配制） 2 mL→煮沸15 min→冷却后分别测定OD600和OD532。ASA测定。 计算： MDA content = (mmol.g-1FW) 返回

二、热激诱导的玉米幼苗耐热性的可能机制 抗氧化酶系统，包括过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）、过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）等。 抗坏血酸含量的测定 脯氨酸（Pro）含量的测定 蛋白质含量的测定

抗氧化系统测定实验背景 CAT、APX、POD、PPO是植物体中非常重要的末端氧化酶， CAT、APX、 POD可以清除植物体内多余H2O2，PPO可以把酚类物质转变为醌，后者对病原微生物起重要的抑制和杀伤作用。因此，它们在植物抗病性、抗热性等抗逆性中起着非常重要的作用，是植物抗逆性的重要生理指标。

O2 高O2亲和力，占耗氧量80% NADH/NADPH FMN UQ cytb cytc1 cytaa3 交替氧化酶，抗CN- PPO，抗病及伤，对O2亲和力弱 APX，抗逆性 乙醇酸氧化酶 对O2亲和力极低 黄素氧化酶，对温度不敏感 CAT，抗逆性 POD，抗逆性 SOD，抗逆性

抗氧化酶与植物抗逆性关系

抗氧化酶动力学曲线

植物抗氧化酶提取和测定参考文献 返回

１、四种抗氧化酶的提取 分别取0.5 g实验组和对照组的胚芽鞘→加入少许石英砂和3 ml提取液（50mmol/L PBS, pH7.0,内含0.１mmol/LEDTA, 0.2 mmol/L ASA,1%PVP） → 充分研磨　→转入离心管中→用2ml提取液洗研钵→ 10000 rpm离心10 min →上清液定容至5 ml →测定四种酶活性或分装后转至-20或-80℃保存。 　

2、CAT和APX活性的测定 原理 　H2O2和ASA分别在240和290 nm处有最高吸收峰，它们的毫摩尔吸收系数ε分别为0.0４和2.8 mM-1cm-1。因此，可以用单位时间内H2O2或ASA的消耗量分别表示CAT或APX活性。 CAT活性测定：反应混合液（ 50mmol/L PBS,pH7.0,内含１０mmol/L H2O2 ）2.9 ml→加入50 ml酶液→25℃预热５ min →加入600 mmol/L H2O2 50ml 启动反应→分别读出反应0.5 min和3.5 min的OD值→求出ΔOD240。

APX活性测定： 反应混合液（ 50mmol/L PBS, pH7.0,内含1 mmol/L ASA ）2.9 ml→加入50 ml酶液→25℃预热５ min →加入60 mmol/L H2O2 50ml →分别读出反应10 Sec和60 Sec的OD值→求出ΔOD290。 CAT或APX activities = (mmol.g-1FW)

1、愈创木酚（4-邻甲氧基苯酚） + H2O2 —— 四邻甲氧基苯酚 3、POD和PPO活性的测定 原理 　1、愈创木酚（4-邻甲氧基苯酚） + H2O2 —— 四邻甲氧基苯酚 （Amax = 470nm，ε = 26.6 mM） 2、邻苯二酚 ——— 邻醌 （Amax = 410nm） POD测定：取POD反应混合液（10　mmol/L愈创木酚，5 mmol/L H2O2,用PBS溶解）2.95 ml，加入酶液50 ml（空白调零用PBS取代），立即记时，摇匀，反应3 min，测出A470。

PPO测定：取PPO反应混合液（ 20 mmol/L邻苯二酚，用PBS溶解）2. 8 ml，加入酶液0 PPO测定：取PPO反应混合液（ 20 mmol/L邻苯二酚，用PBS溶解）2.8 ml，加入酶液0.2 ml（空白调零用PBS取代），立即记时，摇匀，反应 2 min，测出A410。 以每分钟A值变化0.01所需要的酶液的量为一个活力单位（U），则： POD activities = (mmol.g-1FW) PPO activities = (U.g-1FW)

４、抗坏血酸含量的测定 原理：还原型抗坏血酸（ASA）可把Fe3+还原为Fe2+，后者与红菲罗啉反应形成红色螯合物，最大光吸收为534 nm． 抗坏血酸的提取：同MDA提取． ASA测定：1 ml样品→加入1 ml 5%TCA→1 ml无水乙醇→摇匀→0.5 ml 0.4% H3PO4－乙醇→1 ml 0.5% 红菲罗啉（BP）－乙醇→0.5 ml 0.03% FeCl3－乙醇→30℃水浴30 min→OD534

DASA测定： 1 ml样品→加入0. 5 ml 60 mmol/L DTT －乙醇→0 DASA测定： 1 ml样品→加入0.5 ml 60 mmol/L DTT －乙醇→0.5 ml　Na2HPO4－NaOH混合液使溶液的调至7～8→室温10 min→0.5 ml 20% TCA把调到1~2→按上述方法测定． 标准曲线的制作：以5%TCA为溶剂配制2，4，6，8，10 mg/ml ASA按上述方法制作标准曲线或根据K = 0.187 (mmol/L)-1cm-1计算．

脯氨酸测定实验背景 植物在遇到干旱、高温、低温、盐渍等逆境胁迫情况下，植物体内通过①蛋白质的降解、②从头合成和③降低脯氨酸氧化酶活性等途径合成脯氨酸（Proline, Pro）,Pro具有保护蛋白质（酶）、降低植物细胞水势、清除ROS等复杂的生理功能，从而提高了植物对逆境的抵抗能力。

Pro具有保护蛋白质（酶）、降低植物细胞水势

清除ROS

Pro提取与测定方法参考文献

５、Pro含量的测定 原理 　植物在遇到干旱、高温、低温、盐渍等逆境胁迫情况下，植物体内通过①蛋白质的降解、②从头合成和③降低脯氨酸氧化酶活性等途径合成脯氨酸（Proline, Pro）,从而提高了植物对逆境的抵抗能力。 　在酸性条件下与茚三酮发生反应生成红色化合物，此化合物在520 nm处有最高吸收峰，ε= 3.24mM-1.cm-1 。

Pro的提取：分别取0.5 g实验组和对照组的胚芽鞘→加入3 mL 3%磺基水杨酸（SSA）和少许石英砂→充分研磨→用2 mL 3% SSA洗研钵→10000 rpm离心10 min →上清液定容至5 mL。 测定：上清液各2 mL →分别加入2 mL冰乙酸和2 mL茚三酮试剂→煮沸15 min→冷却后分别测定A520 计算： Pro content = (mmol.g-1FW)

595 nm G250蛋白质复合物 465 nm G250 返回

６、蛋白质含量的测定 原理：考马斯亮蓝的最大光吸收为465 nm，它与蛋白质结合后最大吸收峰转移至595 nm，并且反应迅速（2 min），稳定性好（1h）。 蛋白质的提取：同抗氧化酶的提取。 测定方法——考马斯亮蓝染色法：0.1 ml上清液→加入５ ml 0.01%考马斯亮蓝G250→摇匀→测定OD595。

计算：根据ε= 0.0083(ug/ml)-1.cm-1计算蛋白质含量（mg.g-1FW）。 G250试剂： 100 mg G250→用50 ml 95%乙醇溶解→加入100 ml 85%磷酸→摇匀→用蒸馏水定容至1000 ml → 室温下贮存于棕色瓶中。

附：722S分光光度计的使用方法

调“0” 调“100” 722S使用 测定