实验四 球菌、杆菌

实验内容 一，血浆凝固酶试验（球菌） 二，肥达试验（Widal Test）（杆菌）

Pyogenic coccus 奈瑟菌 葡萄球菌 链球菌

葡萄球菌 Staphylococcus

p. 106，《医学微生物学》，第二版，贾文祥主编，人民卫生出版社。

链球菌 Streptococcus

Streptococcus pneumoniae 肺炎链球菌 Streptococcus pneumoniae

溶血试验 hemolysis test Bacteria are grown on sheep blood agar plates (containing 5% sheep blood): α- hemolytic reaction, partial hemolysis with a green coloration： Streptococcus pneumoniae β- hemolytic reaction, complete hemolysis： Staphylococcus aureus Streptococcus pyogenes γ - hemolytic reaction, no hemolysis: Staphylococcus epidermidis most strains Staphylococcus saprophyticus

奈瑟菌 Neisseria

临床应用举例： 脓汁标本病原性球菌的分离鉴定 涂片、革兰染色、镜检 37℃ 24h 观察菌落特征 及溶血情况 血琼脂平板 生化反应、致病力试验及药敏试验

绿色不完全溶血环，为甲型溶血性链球菌或肺炎链球菌 G+、葡萄状排列； 菌落中等大小、不透明、金黄色； 完全溶血，可能是金黄色葡萄球菌; 可进一步做： 血浆凝固酶试验 甘露醇发酵试验 G+ 、链状； 菌落小、半透明； 完全溶血，为乙型溶血性链球菌。 G+ 、短链状； 绿色不完全溶血环，为甲型溶血性链球菌或肺炎链球菌 胆汁溶菌 菊糖发酵试验

若在中性粒细胞内外发现G-双球菌，可初步诊断为奈瑟菌： 若在脑脊液标本中发现，极有可能是脑膜炎奈瑟菌； 若在泌尿、生殖系统来源的标本中发现，极有可能是淋病奈瑟菌。

一，血浆凝固酶试验（操作） 一人一组

实验步骤（葡萄球菌血浆凝固酶试验） 取一个载玻片，划分3格，标记1、2、3。 在格内分别滴加： 以接种环挑取细菌混悬于液滴中： 1：兔血浆一滴 2：兔血浆一滴 3：盐水一滴 以接种环挑取细菌混悬于液滴中： 1：金黄色葡萄球菌 2：白色葡萄球菌 3：金黄色葡萄球菌 立即观察结果。

实验内容 一，血浆凝固酶试验（球菌） 二，肥达试验（Widal Test）（杆菌）

肠道杆菌 埃希菌属 沙门菌属 志贺菌属

somatic O Ag (lipopolysaccharide) H Ag (flagella) K/Vi Ag (capsule) somatic O Ag (lipopolysaccharide)

二，肥达试验（Widal Test）（操作） 4人一组

肥达试验（Widal Test） 用已知伤寒沙门菌O、H抗原，以及甲型副伤寒、肖氏沙门菌、希氏沙门菌H抗原的诊断菌液与受检血清作定量凝集试验，测定受检血清中有无相应抗体及其效价的试验。 用途：辅助诊断伤寒，副伤寒

熟悉肥达试验的 操作方法 结果观察 结果分析

肥达试验结果观察- 凝集反应的强弱标准 “++++” 液体清澈透明，菌体全部被凝成块，沉于管底 “+++” 液体较透明，大部分菌体被凝集而沉于管底 “++” 液体稍透明，管底有少量凝集沉淀物 “+” 液体较混浊，可见极少量凝集物 “-” 液体混浊，细菌因重力下降于管底呈边缘光滑圆点（与对照管相似）

肥达试验结果观察-血清效价 能与一定量的抗原发生肉眼可见的明显凝集（即“++”凝集）的血清最高稀释倍数，称为血清的效价。血清的效价代表着血清中抗体的含量，其效价愈高，所含抗体的量愈多。 如血清最低稀释倍数（1∶40）仍无凝集，则视为阴性或效价低于1∶40；如血清的最高稀释倍数（1∶1280）仍完全凝集，则示血清效价高于1∶1280。

实验步骤 取小试管32支，分成4排，每排8支，依次标号，并于小试管内各加入0.5ml生理盐水： 1-1、1-2、1-3、1-4……1-8 2-1、2-2、2-3、2-4……2-8 3-1、3-2、3-3、3-4……3-8 4-1、4-2、4-3、4-4……4-8 在每一排第1管中各加患者血清0.5ml，吸打混匀，吸取0.5ml 加入第2管稀释，从第2管吸取0.5ml加入第3管……依此作对倍稀释至第7管，弃去0.5ml。第8管不加血清作为空白对照。 2~4排按同法稀释。第8管均不加血清作为空白对照。 按8、7、6、5、4、3、2、1的顺序，分别加入抗原: 第1排各管:加入伤寒H抗原0.5ml 第2排各管:加入O抗原0.5ml 第3排各管:加甲型副伤寒(PA)H抗原0.5ml 第4排各管:加乙型副伤寒(PB)H抗原0.5ml 。 将各管混匀，置37℃水浴箱中16~18小时后观察结果。

粪便标本肠道杆菌的分离鉴定 克氏双糖铁 培养基 粪便 SS 平板 EMB平板 挑取可疑菌落 尿、靛、动 培养基 分析结果

生化反应 乳糖 葡萄糖 硫化氢 尿素 靛基质 动力 大肠杆菌 黄色 + - - + + 痢疾杆菌 红色 + - - +/- - 乳糖 葡萄糖 硫化氢 尿素 靛基质 动力 大肠杆菌 黄色 + - - + + 痢疾杆菌 红色 + - - +/- - 伤寒杆菌 红色 + +/- - - + 副伤寒杆菌 红色 + + - - + 变形杆菌 红色 + + + +/- + + 糖发酵阳性，且产气 + 反应阳性

SS（stainless steel）平板－分离肠道病原菌的强选择培养基 成分和作用： 基础培养基：提供氮源和碳源 胆盐、枸橼酸钠、煌绿：可抑制肠道非致病菌的生长，而对肠道致病菌抑制作用弱 乳糖，中性红（pH6.8-8.0，红→橙黄） ：致病菌不分解乳糖，但分解蛋白胨产生碱性物质，菌落淡黄色；非致病菌分解乳糖产酸，菌落呈红色 病原菌:小,白色至淡黄色 非致病菌:大,红色

乳糖发酵 结果： - 白色菌落：致病菌 + 红色菌落：非致病菌 SS平板

EMB（Eosin Methyl Blue)平板－分离肠道病原菌的弱选择培养基 成分和作用： 基础培养基：提供氮源和碳源 伊红、美蓝：可抑制肠道非致病菌的生长，而对肠道致病菌抑制作用弱 乳糖：致病菌不分解乳糖，菌落无色半透明；大肠杆菌分解乳糖产酸，菌落呈紫黑色 病原菌:半透明,无色 非致病菌:紫黑色

克氏双糖铁（KIA）培养基 接种方法：用接种针挑取待检菌的菌落，先穿刺接种到KIA深层，距管底3~5mm为止，再从原路退回，在斜面上自下而上划线，置35℃孵 育18~24h，观察结果 如何观察 观察上层含乳糖部分 乳糖发酵：致病菌红色，非致病菌黄色 H2S 观察下层 发酵葡萄糖（产酸产气） 动力 乳糖 硫酸亚铁 固体 葡萄糖 半固体 指示剂:酚红

Urease test Principle: The hydrolysis of urea by urease produces ammonia and carbon dioxide. Ammonia alkalinizes the medium, and the pH is detected by the color change from light orange to pink-red. Medium: urea agar slant Indicator: phenol red Positive result: pink-red color Negative result: light orange

Indole （吲哚，即靛基质 ） test Medium: tryptone broth, a rich source of the amino acid tryptophan Indicator: Kovac‘s reagent (p-dimethylaminobenzaldehyde，对二甲基氨基苯甲醛) Principle: E. coli produce tryptophanase, an enzyme that cleaves tryptophan（色氨酸）, producing indole, which turn the color dark pink.