DNA的提取 田秀君.

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DNA的提取 田秀君

鉴于从现场收集的麻风标本多为全血,皮肤活检标本,鼻拭子,因此着重介绍从全血,皮肤活检标本中提取DNA的方法。

实验一 皮肤组织中的DNA的提取

实验目的:掌握从皮肤组织中提取麻风基因组DNA的方法 原理及应用:麻风基因组DNA通常先用SDS裂解,蛋白酶K消化细胞,利用酚,酚/氯仿抽提纯化,经异丙醇或乙醇沉淀,获得基因组DNA。适用于PCR扩增,Southern分析等实验。

商品化的试剂盒不需要酚/氯仿纯化,乙醇沉淀,而是将皮肤组织经裂解液裂解,将裂解后的液体进入含硅藻滤膜的纯化柱,基因组DNA被吸附,洗液穿过纯化柱被抽走。这种方法具有快速,简便,安全的优势。

方法一: 使用商品化的试剂盒提取基因组DNA

实验材料 一 试剂盒成分:QIAamp DNA Blood Mini Kit 本实验使用量 QIAamp Spin Column 1个 Collection Tubes 2个 Buffer ATL 180ul Buffer AW1 500ul Buffer AW2 Buffer AE 100ul QIAGEN Proteinase K 20ul

二, 其他试剂,仪器及耗材 1.5ml的离心管 旋涡混合器 55℃ 水浴箱 台式离心机(14000 rpm) 96-100%乙醇 0.8%琼脂糖凝胶及电泳装置

实验步骤 准备样本 将皮肤组织标本从70%的酒精中取出,放入1 ×TE中浸泡1小时,取出后用消毒的剪刀,镊子将其剪成肉泥状。

消化样本 将肉泥状的皮肤组织放入EP管中,加入消化液ATL180ul和蛋白酶K20ul,55 ℃消化大约72h,期间用旋涡混合器振荡混合助溶。消化好的样本成清亮透明。

加入200ul的溶液AL,旋涡混合均匀 70 ℃孵育10min,加热灭活蛋白酶K 加入200ul的(96-100%)的乙醇,旋涡混合数秒 轻轻的将离心管内的混合物转移到 离心柱内(切勿接触到离心柱沿), 盖上管盖,8000rpm离心1分钟

将离心柱置于一个干净的2ml 收集管内, 将含有过滤物的旧管丢弃 加入500ul的溶液AW1, 8000rpm离心1分钟

加入500ul的溶液AW2, 14000rpm离心3分钟 将离心柱置于一个干净的2ml 收集管内, 将含有过滤物的旧管丢弃

洗脱基因组DNA 将离心柱置于一个干净的1.5ml 的离心管内, 将含有过滤物的旧管丢弃 加50ul的溶液AE 室温孵育5分钟

8000rpm离心1分钟 离心后的管底溶液即为所提取的DNA 检测:琼脂糖凝胶电泳法观察基因组DNA

实验二 从全血中提取DNA

实验目的:掌握从人的全血中提取基因组DNA的方法。 原理及应用:大体与从皮肤组织中提取的原理及应用相同。

实验材料 一 试剂盒成分:DNeasy Tissue Kit 本实验使用量 QIAamp Spin Column 1个 Collection Tubes 2个 Buffer AL 200ul Buffer AW1 500ul Buffer AW2 Buffer AE 100ul QIAGEN Protease 20ul

实验步骤 (一)准备样本 将冻存在-40 ℃的样本取出,在37 ℃水浴中迅速解冻,融化。

离心法纯化基因组DNA 在1.5ml 的离心管底加入20ul的蛋白酶 在离心管中加入200ul的全血 再加入200ul的溶液AL,旋涡混合15秒 56℃孵育10分钟

瞬时离心将离心管盖上的样品甩下来 加入200ul的(96-100%)的乙醇, 旋涡混合15秒。瞬时离心。 下述步骤同从皮肤组织中提取DNA

提取鼻拭子DNA的方法 刘健

将Ep管放入4°C冰箱静置4-6小时 从冰箱中取出Ep管,挤干鼻拭子 的水分,并弃去鼻拭子 在1.5ml Ep管中放入500ul PBST

加入50ul 0.1M的Tris-Hcl/EDTA, 将Ep管放入4°C离心机, 离心20min,13000转 取出Ep管,小心地吸去 上清,保留沉淀 加入50ul 0.1M的Tris-Hcl/EDTA, 反复冻融(-40°C---90°C)3次 加入10ul 20ug/ml蛋白酶K, 在56°C水浴箱中孵育过夜

在放入100°C中灭活10min 放入-20°C冰箱中保存