碱变性法小量提取质粒， DNA的限制性酶切 厦门大学医学院 分子生物学实验教学组

实验目的 掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。 掌握质粒酶切鉴定原理, 学会根据目的基因和实验目的选择合适载体与限制性内切酶，设计构建体外重组分子。

质粒(plasmid) 是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器（主要指线粒体和叶绿体）和细菌细胞中染色体以外的DNA分子，在基因工程中质粒常被用做基因的载体。 是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器（主要指线粒体和叶绿体）和细菌细胞中染色体以外的DNA分子，在基因工程中质粒常被用做基因的载体。

分离质粒DNA的 基本步骤 培养细菌使质粒扩增； 收集和裂解细菌； 分离和纯化质粒DNA

质粒DNA的提取方法 碱变性法（碱裂解法）； 煮沸裂解法； 羟基磷灰石柱层析法； 质粒DNA释放法； 酸酚法等。

碱变性（裂解）法基本原理： 在碱性条件下（pH 12.6），染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当以pH 4.8的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA与大分子RNA、蛋白质SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

原理示意图

质粒DNA电泳 电场中DNA分子的迁移速度取决于： DNA分子本身的大小 DNA分子的空间构型 超螺旋构型（ccDNA) 线形DNA(lDNA) 开链环状DNA(ocDNA) 复制中间体（没有复制完的两个质粒连在一起)

溴化乙锭（EB）是一种荧光染料(3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐)，其分子可以嵌入到核酸的碱基对之间，在紫外线的激发下，发出橙色荧光

Attention, please! EB是强诱变剂，配制和使用EB染色液时，应带乳胶手套或一次性手套，并且不要将该染色液洒在桌面或地面上，凡是沾污EB的器皿或物品，必须进行清洗或弃去！

质粒提取实验材料与试剂 实验材料： 过夜培养大肠杆菌DH-5a 实验试剂： LB培养基 0.1M NaCL、10mM Tris.CL（pH8.0）、1mM EDTA、Amp 50mg/ml、酚、氯仿、Rnase、琼脂糖 TE：10mM Tris.CL （pH8.0），1mM EDTA 溶菌酶 10mg/ml（用10mM Tris.CL，pH8.0，新鲜配制）

溶液Ⅰ—溶菌液：50mM 葡萄糖，25mM Tris.Cl（pH8.0），10mM EDTA，2mg/ml 溶菌酶。 溶液Ⅱ— NaOH-SDS液：0.2N NaOH，1% SDS。 溶液Ⅲ— 3mol/L NaAc（pH4.8）溶液：5M KAC 10ml，冰醋酸 11.5ml，水 28.5ml。

步骤一 细菌培养与质粒扩增 1. 挑单克隆E.coli菌株接种到4ml LB培养液中（含Amp 50µg/ml），37 ℃225rpm振荡培养过夜。 （活化菌种） 2.从中取2ml种子菌液于含Amp培养基500ml中，37℃振荡培养3-4小时（OD600＝1.0） 3.取4ml培养液至Eppendorf管中，12000 rpm，4 ℃离心30秒，弃上清，用1ml STE悬浮菌体，再离心回收菌体，并重复一次，弃上清，取沉淀。

步骤二 质粒提取 取4ml培养物至Eppendorf管中，12000rpm，4℃，离心30sec，弃上清。 步骤二 质粒提取 取4ml培养物至Eppendorf管中，12000rpm，4℃，离心30sec，弃上清。 用1ml STE悬浮菌体，再离心回收菌体，并重复一次，弃上清取沉淀，使细胞沉淀尽可能干燥。 将细菌沉淀悬浮于100μl预冷的溶液I中，加入10 µl溶菌酶（10mg/ml），剧烈振荡均匀，冰上放置1分钟。 加200μL溶液II（新鲜配制），盖紧Eppendorf管，快速轻柔颠倒5次，混匀内容物，将Eppendorf管放在冰上3分钟 。

5. 加入150μL溶液III （冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀，冰上放置5min。 6 5.加入150μL溶液III （冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀，冰上放置5min。 6.12000rpm， 4 ℃离心5min，将上清夜转至另一1.5ml Eppendorf管中。 7.加入等体积酚/氯仿（1：1），振荡混匀，室温放置5-10min，12000 rpm，4 ℃下离心2分钟，倒去上清，把Eppendorf管倒扣在吸水纸上，吸干液体。 8.加入2倍体积冰预冷无水乙醇，振荡混匀，12000 rpm 4 ℃离心5分钟。

9. 倒去上清，加入1ml冰预冷70%乙醇振荡漂洗DNA沉淀。12000 rpm，4 ℃离心2分钟。 10．弃上清并尽量吸除液体，打开管盖，室温放置5min。室温放置15min干燥。 11．50µl TE缓冲液(含无DNase的RNase 20 µg/ml)，使DNA完全溶解（-20℃保存） 12．取样品10 µl加2ul 6× Loading buffer于1 %琼脂糖电泳，电泳凝胶在凝胶成像系统上成像。

M pBSK pGFP

质粒DNA提取常见问题 问题一：未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？ 对 策 原因 请涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养 可减少菌体用量或增加溶液的用量 不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。检查抗生素使用浓度是否正确。 溶液Ⅱ在温度较低时可能出现浑浊，置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的溶液。 菌体老化 碱裂解不充分 菌体中无质粒 溶液使用不当 对 策

质粒DNA提取常见问题 问题二：质粒纯度不高，如何解决？ 对 策 原因 不要使用过多菌体。重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质 加入RNaseA室温放置一段时间 加入溶液II 和III后防止剧烈振荡，可能把基因组DNA剪切成碎片从而混杂在质粒中。细菌培养时间过长会导致细胞和DNA的降解，培养时间不要超过16小时。 对 策 混有蛋白 混有RNA 混有基因组DNA

提高质粒产量的注意事项 加入溶液I 后，涡旋振荡应充分打散菌体使之均匀悬浮； 加溶液II裂解要完全(快速轻柔颠倒5-10次) ，使蛋白质和核酸变性； 加溶液III后PH要达到中性(轻柔振荡5-10次 )，使质粒DNA复性，这样才能使质粒DNA与染色体DNA完全分开，否则，难分开，所以裂解和复性这两步要从严掌握。 加入乙醇沉淀DNA时，要把离心管盖上盖子倒翻摇动几次，注意观察水相和乙醇之间没有分层现象之后，才可以放到冰箱中去沉淀DNA。

DNA的限制性酶切

Plasmid (质粒) Plasmid map Polylinker Sequence map Restriction enzyme map

Polylinker (多克隆位点） 895-1010

Sequence Map GACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTT AAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACA ACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCG ATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTC ATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCG CCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCC ATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCC AAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTA TGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGC AGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAA TGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACG CAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCA CTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTT AAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTCTGCAGATATCCAGCACAGTGGCG GCCGCTCGAGTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCA TCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAAT AAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGA CAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAG GCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGG GTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTT CCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTC CGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCAT CGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCA AACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCC TATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTT AGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCA ACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAG CAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCC CCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAG TAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCG GATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCC GGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCC………

Restriction map

限制性核酸内切酶: 一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶。 限制性切酶以内切的方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5’端带磷酸基团，3’端为-OH。

限制性核酸内切酶分类 识别切割特性 催化条件 是否具有修饰酶活性 至2005年1月，共发现限制酶3681种 Ⅰ 型59种 Ⅱ 型3612种 Ⅲ 型10种 商业化的限制酶有 588 种，在 Ⅱ 型限制酶中共有 221 种特异性。

EcoRI Structure of the homodimeric restriction enzyme EcoRI (cyan and green cartoon diagram) bound to double stranded DNA (brown tubes) based on the PDB 1QPS X-ray crystallographic coordinates. Two catalytic manganese ions (one from each monomer) are shown as magenta spheres and are adjacent to the cleaved sites in the DNA made by the enzyme (depicted as gaps in the DNA backbone).

Ⅱ型限制与修饰系统 占90%以上，即通常指的DNA限制性内切酶，它们能识别双链DNA的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异的DNA片段； Ⅱ型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识别顺序一般为4-6个碱基对的反转重复顺序； Ⅱ型内切酶切割双链DNA产生3种不同的切口：5’端突出，3’端突出和平末端。

酶切反应中应注意以下几个问题： 1. 内切酶：不应混有其他杂蛋白特别是其他内切酶或外切酶的污染；注意内切酶的识别位点和形成的粘性末端； 2. 内切酶的用量：根据内切酶的单位和DNA用量而定。使用中一般以1 µg DNA用2-3U酶进行酶切为宜； 3. 内切酶体积：不能超过反应体系的10%，因内切酶中含50%甘油，体系中甘油超过5%会抑制内切酶的活力； 4. 操作条件：反应体系配置应在低温下进行（冰上）；使用时防止操作中对内切酶的污染。

5. DNA：作为内切酶的底物，DNA应该具备一定的纯度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、SDS和酒精等，这些因素的存在均在不同程度影响限制性内切酶的活性。

反应缓冲液： 1. 反应缓冲液: 主要由Tris-HCl、NaCl、Mg2+组成，其中Mg2+ 为内切酶的辅基； A. Tris-HCl维持反应体系的PH值在7.2~7.6之间； B. NaCl浓度： 低盐(10mM NaCl) 中盐(50mM NaCl) 高盐(100mM NaCl)

2. 酶解的温度：大多数限制酶的反应时间为37℃，如EcoRⅠ、HindⅢ、BamHⅠ、PstⅠ等，也有如BclⅠ需在50℃下进行反应。 3. 酶解反应时间：根据酶的单位与DNA用量之比来定，原则是酶/DNA＝2~3，12小时即可充分酶解。 4. 酶单位定义：在每种内切酶理想的反应条件下 ， 0.05mL反应混合物中, 1小时消化1μg底物DNA的酶量为1单位(1U)。

双酶切实验材料 限制性内切酶：EcoRⅠ、XbaⅠ和HindⅢ DNA：λDNA和质粒pCDNA-p38 10×buffer H （37℃, PH7.5） 90mM Tris•Cl 50mM NaCl 10M MgCl2 10×buffer M（37℃, PH7.5） 6mM Tris•Cl 100mM NaCl 6M MgCl2 1mM DTT 10×BSA： 1mg/ml 无菌水

方法和步骤 1. 反应体系配制： ————————————————— 总体积 20 µl 质粒pCDNA3－p38 10 µl（1µg） 10×buffer M 2 µl 10×BSA 2 µl EcoRⅠ 1 µl XbaⅠ 1 µl H2O 4 µl ————————————————— 总体积 20 µl

2. 将反应体系充分混匀，并于台式离心机上短暂离心收集液体。 3. Eppendorf管于37℃水浴中反应1.5小时。 4. 反应结束后70℃灭活15min或者加入EDTA至终浓度10mM终止反应。 5. 取20µl反应液加入6×loading buffer混匀于1.2％琼脂糖凝胶胶上150伏电泳，约30min。 加入5µl未酶切对照。 6. 凝胶成像体系观察记录结果。 7.当DNA条带充分分开后，在紫外灯下细心切取所要的DNA条带。尽量去除多余的凝胶。紫外灯照射DNA片段不要超过30秒。注意保护眼睛免受紫外线伤害。

实验结果 双链DNA样品浓度(μg/μl) = OD260×核酸稀释倍数×50/1000。 RNA样品浓度(μg/μl) = OD260×核酸稀释倍数×40/1000。 （在波长260nm紫外光下，1 OD值的吸光度相当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA为37 μg/ml；RNA为40 μg /ml。）

凝胶成像结果 1.2% Agarose Gel 1.1000bp DNA ladder 2. CDNA3-p38/EcoRI+XbaI 1 2 3 4 1.1000bp DNA ladder 2. CDNA3-p38/EcoRI+XbaI 3. ppCDNA3-p38 4.100bp DNA ladder

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Gel I 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Gel II

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Gel III 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Gel IV

思考题 1.要得到高质量质粒样品，用碱变性法小量提取质粒时要注意什么事项？ 2.溶液I、溶液II和溶液III的作用是什么？在实验中分别加入上述溶液后反应体系出现的现象及其成因是什么？ 3.酚氯仿抽提时DNA溶液体系出现什么现象？为什么？ 4.沉淀DNA时为什么要用无水乙醇及在高盐、低温条件下进行？

5. 在整个酶切反应过程中应注意哪些问题？ 6. 如何选择DNA和限制性内切酶的用量？ 7. 反应体系中为何内切酶用量不能超过整个反应体系的10%？