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ENZYME 1 : 澱粉液化酶(Α-AMYLASE) 的測定

目的 : 使用Wolgemuth法，求出力價的方法。

力價 : 單位時間內基質被酵素作用產生一固定量生成物 所需之酵素量稱之，單位為unit。 力價的用途： 酵素活性高低乃以其力價表示。

於力價定義下，如同一酵素作用之基質不 同，且作用條件溫度、不同，而所釋出之 生成物以1μ mole或1μg或1mg表示，所 得力價含量即有相當差異。所以同一酵素， 以不同力價定義表示，則含量亦異。因此 在比較酵素活性高低，應就同一條件下加 以比較才是正確的。 力價比較限制：

原理 : 澱粉是屬於多醣類，由澱粉醣及膠澱粉所組成的 大分子化合物。 澱粉醣由200至300個葡萄糖分子以直鏈排列所構 成；膠澱粉則是以含有磷酸根的支鏈所構成。常 加以碘液使生成藍色而作為定性試驗。 分解澱粉的酵素叫澱粉酶或澱粉水解酶，它會使 澱粉分解成麥芽糖、葡萄糖及糊精等小分子化合 物，而無法使碘液變色，由此可以測得澱粉水解 酶是否將澱粉分解成小分子物質。 原理 :

碘液、澱粉與澱粉酶作用機制: 受質 (澱粉) 酵素 (澱粉酶) 碘液 麥芽糖 葡萄糖 等小分子 糊精 被酵素分解而形成的小分子: 黃褐色 葡萄糖 等小分子 糊精 被酵素分解而形成的小分子: 黃褐色 未被分解依然是大分子: 藍紫色 碘液、澱粉與澱粉酶作用機制:

材料: 6支玻璃試管 6個附蓋塑膠小管 (eppendorf) 試管架與標號用簽字筆 控溫水浴槽 吸注器 (pipette) 與 吸注管 (tip) 1%澱粉溶液 澱粉酶 (Stock) 1200μl 1倍磷酸鹽緩衝溶液 (1X PBS buffer)

步驟- 1: (1) (2) (3) (4) (5) (6) (1)找6支試管洗淨、瀝乾備用 (2)將試管由1編號至6號 (3)將1%可溶性澱粉溶液5ml分別加入編號1~6的各試管， 並全部放入水浴槽以40℃預溫

步驟- 2: Stock 1/10 1/10000 1/1000 1/100 Blank Dilute X10 Blank (1) (2) (3) (4) (5) (6) Blank (1) (2) (3) (4) (5) (6) PBS (μl) 990 1080 ddH2O (μl) 10 酵素 (μl) Stock 1200 120

步驟- 3: Stock 1/10 1/10000 1/1000 1/100 Blank 從各小管中取1ml稀釋好的酵 (1) (2) (3) (4) (5) (6) 從各小管中取1ml稀釋好的酵 素分別加入對應號碼的試管中 (1) (2) (3) (4) (5) (6)

步驟- 4： (1)將混合好的酵素-澱粉溶液置於40℃的恆溫槽反應30分鐘。 (2)等冷卻後，各加0.1N碘溶液3~5滴，並觀察其呈色。 (3) (4) (5) (6) (1)將混合好的酵素-澱粉溶液置於40℃的恆溫槽反應30分鐘。 (2)等冷卻後，各加0.1N碘溶液3~5滴，並觀察其呈色。 (3)選出最接近紫色管的呈紅褐色混合液試管。

步驟- 5： 計算方法： 由呈色為最為接近深藍紫色的深紅褐色之試管的酵素添加量，算出被酵素液分解的1%澱粉溶液ml數，此酵素液的力價，依下列公式求出。 A (ml) D = ─── × 澱粉液體積(ml) 1 反應溫度(℃) 反應時間(min) D：澱粉液化力(力價) A：酵素液量(ml)

注意事項： D = ─── × 澱粉液體積(ml) × 稀釋倍數 1 A (ml) 如果酵素力價太高，全部褪色至黃褐色以下時，碘澱粉反應的變化則不在範圍內呈現，此時應將原來的酵素溶液稀釋，用稀釋液依照本法操作，力價 D 依照原來的酵素溶液算出，乘以稀釋倍數n，公式如下： A (ml) D = ─── × 澱粉液體積(ml) × 稀釋倍數 1 反應溫度(℃) 反應時間(min) D：澱粉液化力(力價) A：酵素液量(ml) n：稀釋倍數

稀釋酵素的原因與理由： 酵素濃度太高而受質濃度太少容易造成「反應過 剩」而無法測出真正的酵素力價。

受質 (澱粉) 等於 酵素少受質過多， 故反應不完全 酵素多而受質少 ，故反應過度 酵素濃度與受質做量相 當，故反應洽量 酵素濃度 小於 可接受之受質(澱粉)反應平衡 受質 (澱粉) 等於 酵素濃度與受質做量相 當，故反應洽量 酵素少受質過多， 故反應不完全 酵素多而受質少 ，故反應過度 大於 可接受之受質(澱粉)反應

預期結果: Blank 黃 紅褐 藍紫 (1) (2) (3) (4) (5) (6)

計算範例與力價的比較: 範例: 40 ℃下，與 10 ml 反應 30 分鐘，試比 較添加 x 酵素 2ml與添加 y 酵素0.04ml 之力價。 D30= ─── × 10 = 25 × 10 = 250 0.04 1 40 2 D30 = — × 10 = 0.5 × 10 = 5 X 酵素: y 酵素: 勝

為何所算出的5管稀釋酵素力價均相同? 將酵素做連續稀釋的原因為何? 問題與討論: