实验 出凝血检查 上海交通大学医学院 余文红

（一）血标本的采取应注意的问题

1. PT、APTT凝血实验检查均使用静脉血。采血人员应技术熟练，以防止组织损伤，外源性凝血因子进入针管。

2．一般血液采集，进入容器至进行实验所用的时间越短，所分析的凝血因子被保护得越好。从输液三通管取出血的做法不可取。

3．取血时病人应松驰，环境温暖，防止静脉挛缩，止血带的压力要尽可能小，取血时，拉针栓的速度要慢而均匀，使血液平稳地进入注射器，防止气泡的产生。

4．一旦取样完毕，立即与抗凝剂充分混合，一般提倡使用真空采血管。

5．用硅化玻璃或塑料注射器采血。考虑结果的精确性，应将试管刻度的可能误差控制在既定体积的10%以内。

6.采血后标本在低温保存且在一定时间范围内。

7. 国际血液学标准化委员会（ICSH）、国际血栓与止血委员会（ICTH）推荐使用3. 2g/dl（含2H2O）或0 7. 国际血液学标准化委员会（ICSH）、国际血栓与止血委员会（ICTH）推荐使用3.2g/dl（含2H2O）或0.109mol/L的枸橼酸钠作为凝血因子检查的抗凝剂。

8.抗凝剂在血标本的绝对含量可改变血浆中钙离子浓度，进而影响试验结果，因此应根据患者红细胞比例（Hct）状况随时调整抗凝剂用量。

（二）应用试剂应注意 的问题

1.组织凝血活酶工作制剂的国际敏感指数（ISI），为了使不同敏感性的组织凝血活酶在检测PT中能得到同样的结果，必须要制定一个共同的敏感性指标。

2.凝血活酶和部分活化凝血活酶的使用步骤必须严格按照说明书进行。通常在使用前必须充分混匀试剂，以使微粒重新均匀悬浮于液体中。

3.试剂准备过程中应该使用去离子水。

4.正常对照血浆通常将多份健康人血标本混在一起，以弥补个体误差。

（三）使用实验器材应注意的问题

1. 玻璃器皿的要求：贮存和测试时应选用干净、没有划痕的试管。

2. 温度的要求：人工测定终点法要求水浴箱的温度必须保持在（37±1）℃，并且周围照明设备要好，便于读取终点。

（四）实验操作应注意的问题

1. 许多试验误差都来源于技术的错误。在实验技术、试剂、温度及pH值上很微小的变化都会导致试验结果明显的变化。

2. 手工法PT或试管法CT检查时，倾斜试管动作一定要轻，角度要小，以减少血液与管壁的接触面积。

3. 血液凝固主要是酶催化的反应，所以实验过程中要严格控制理想的pH环境和溶液的离子强度。

4. 试验结果准确还取决于所用的反应物的量、加入顺序和不同反应物的孵育时间。

5. APTT、PT需乏血小板血浆。

6. 试验前检查血浆是否有溶血、黄疸、脂血和出现凝块。

以患者PT（s）/正常对照（s）的比（PTR）报告。 在口服药物治疗监控时以INR报告。 ICSH规定，不再用百分比（活动度）报告。 7. 报告方式： 以PT的秒（s）数报告。 以患者PT（s）/正常对照（s）的比（PTR）报告。 在口服药物治疗监控时以INR报告。 ICSH规定，不再用百分比（活动度）报告。 APTT以秒报告。

1987年WHO提出PT值用INR（international normalized ratio国际标准化比值）作为PT结果报告形式，并用以作为抗凝治疗监护的指标。

INR=［病人PT（s）/正常人平均PT（s）］ISI PTR=受检者PT（s）/正常对照PT（s） INR=PTRISI ISI：国际敏感指数（international sensitivity index）1～1.9

CT、PT、APTT、 RT、Fg、TT

凝 血 时 间 测 定 C T

目的：掌握玻璃试管法凝血时间测定的方法

原理： 离体静脉血与玻璃表面接触后，血中XII因子活化并启动内源性凝血途径，最终生成纤维蛋白而使血液凝固所需的时间。

器材： 6mm直径玻璃试管3支 静脉采血器材 37℃恒温浴箱 秒表

步骤：3支试管各1ml血，每隔0.5min倾斜，第一管计时后，立即观察第二、三管并计时，直至血液凝固。 结果判断：从血液刚进入注射器至第3管凝固所需时间即为凝血时间。

正常参考值：4～12分钟 报告方式：CT X.Xmin（玻璃试管法）

注意事项： 试管应洁净干燥，抽血应“一针见血”且血液中不含泡沫。 温度恒定为37℃，倾斜试管角度应在30°左右。

评价： 凝血时间曾用玻片法测定，但由于毛细血管采血，易混入组织液而使凝血时间正常，属于淘汰方法。 延长：严重内源性凝血途径凝血因子有缺陷；血中抗凝物质增多；肝素治疗 缩短：高凝状态（DIC早期）

凝 血 酶 原 时 间 P T

原理： 在乏血小板血浆中加入组织因子和钙离子（钙凝血活酶）后，血浆发生凝固的时间即为凝血酶原时间（PT）。

步骤： 取空腹静脉血1.8ml加入含有0.2ml109mmol/L枸橼酸钠的试管中混匀备用。 抗凝血以3000r/min离心10min分离血浆 将试剂、正常人混合血浆、待测血浆与37℃预热5min。 血浆0.1ml加入混匀的试剂0.2ml，开动秒表计时。

正常参考值： PT：11～13秒 PTR：1±0.15 INR：0.8～1.5

报告方式： PT：X.Xs，正常人血浆X.Xs PTR：X.X INR：X.X

注意事项： 试管应洁净干燥，抽血应“一针见血”，抗凝剂与血液比例（1：9）应准确。取血后4h内完成测定。 钙凝血活酶必须标有国际敏感指数（ISI），ISI越接近于1.0越敏感。 标本测定前应先测定正常人混合血浆，其PT值在允许范围内才能测定样本。

评价： 血浆凝血酶原是一种筛选试验，是用来证实先天性或获得性纤维蛋白原、凝血酶原和凝血因子V、VII、X的缺陷或相应抑制物的存在，也用于监测口服抗凝治疗时引起的凝血酶原和因子VII、X水平的下降。

实质： 对检测样本（血浆）中存在凝血激酶时的再钙化反应，这种过程包括了因子VIIa、组织因子、磷脂、钙离子对凝血酶原的活化，凝血酶裂解纤维蛋白原和纤维蛋白单体的聚集交联。

活化部分凝血活酶时间测定 APTT

原理： 用白陶土激活XII因子、脑磷脂代替血小板磷脂，测定乏血小板血浆加入Ca2++后凝固所需时间。

步骤： 采血 空腹静脉血1.8ml+0.2ml 109mmol/L枸橼酸钠混匀。 分离血浆 3000r/min离心10分钟分离血浆。 溶解试剂 临用时加1ml蒸馏水，室温静置15min以上，混匀后使用。 预温活化 0.1ml血浆+APTT试剂0.1ml混匀，37℃准确孵育3min（其间轻轻摇动数次） 加钙计时 加入0.1ml 25mmol/L CaCl2混匀并立即开动秒表计时，20s后，观察混合液流动状态。

正常参考值：一般在33.68～40.32s（不同仪器和试剂所测之参考值有差别） 报告方式： APTT：XX.Xs，正常人血浆：XX.Xs

注意事项： 采血时穿刺尽量一针见血，不要淤血和气泡，采血后立即与抗凝剂混合，尽快送往实验室。使用枸橼酸盐（抗凝）血浆 如果不能立即测试，应尽快分离血浆，盛血浆的容器加塞，防止PH值改变 血浆在2～8℃下保留7天 钙凝血活酶必须标有国际敏感指数（ISI），ISI越接近于1.0越敏感。

临床意义： APTT延长： 表明有内源性凝血途径有关因子的缺陷（血友病）和纤维蛋白原缺乏。 纤维活力增加，如继发性，原发性纤溶以及血循环中有纤维蛋白（原）降解产物（FDP）。 血循环中有抗凝物质。

APTT缩短：　　　 高凝状态，如DIC的高凝期，促凝物质进入血液以及凝血因子的活性增高等。

评价： APTT和PT同时检测是目前二期止血缺陷的主要筛选试验组合。

在有临床出血症状的前提下： APTT PT 提示 正常 延长 因子VII的缺陷 延长 正常 因子VIII、IX、XI缺陷 正常 正常 怀疑因子XIII缺陷可能 延长 延长 除因子II、V、I、X缺陷 外，主要是异常抗凝物质 的增多

血浆复钙时间 RT

原理： 在去钙离子的抗凝血浆中，重新加入适量的钙后，血浆发生凝固。

步骤： 0.2ml 0.1mol/L草酸钠+静脉血1.8ml混匀，离心分离血浆。 0.1ml血浆置37℃水浴中，+0.025mol/L CaCl2 0.1ml，立即开动秒表记录时间。

正常参考值： 2.08±0.49分（2.18~3.77分钟）

注意事项： 不要溶血，否则时间缩短 CaCl2新鲜配制 分离血浆以1000转/分为宜，高速离心可使大量血小板下沉而导致复钙时间延长。

复钙交叉时间 RT

步骤： 按下列比例准备5份待测血浆： 加样量 1 2 3 4 5 受检血浆（ml）－ 0.01 0.05 0.09 0.10 加样量 1 2 3 4 5 受检血浆（ml）－ 0.01 0.05 0.09 0.10 正常血浆（ml）0.10 0.09 0.05 0.01 － 上述试管，置37℃ 1min，加0.025mol/LCaCl2 0.1ml，混匀后，记录血浆凝固时间。

注意事项： 所用血浆均为富含血小板血浆，分离出血浆后需在2h内检测完毕。

临床意义： RT最早作为内源性凝血系统相关凝血因子缺陷的筛选检查，但由于这个试验不如APTT，又容易受血小板数量和功能影响，目前只用来筛选是否存在病理性抗凝物质增多。

延长的复钙时间如被1/10量的正常血浆所纠正，则表示受检血浆中缺乏内源凝血因子；如不被少量正常血浆纠正，提示存在异常抗凝物质。

血浆纤维蛋白原 Fg

基于经加凝血酶后，形成纤维蛋白的方法，即可凝固蛋白法。 纤维蛋白原的测定方法众多，大体上分三大类： 基于经加凝血酶后，形成纤维蛋白的方法，即可凝固蛋白法。 物理、化学测定法。 免疫学测定法。

目的和原理

为了解凝血途径最后环节的状况，排除纤维蛋白原减少、异常对凝血筛选试验的影响，了解纤溶活动度等可选择本试验。

Clauss法以凝血酶作用于受检血浆中的纤维蛋白原，使其形成纤维蛋白，血液凝固。

纤维蛋白原的量与凝固时间成负相关，检测结果与参比血浆制成的标准曲线对比可得出纤维蛋白原的含量。

步骤： 将参比血浆用血浆稀释液作原倍、1：2、1：4、1：8、1：16稀释5管。 取稀释血浆0.2ml于小试管中，置37℃水浴预热2分钟，再加凝血酶溶液0.1ml，记录时间。

相关分析： 首先先清除内存。INV+AC，浓度（log或In）XD，YD输入（如不取对数，浓度直接输入XD，YD 读取值DATA输入；全部数据输入完毕，按INV+9读出相关系数r。 待测读数INV+log或In→读出相关浓度。 如不取对数，待测读数直接INV+ŷx→读出相关浓度。 最终浓度需根据样品稀释倍数乘积。 ^

标准曲线： t（s） 25 20 15 10 5 0.5 1 1.5 2 2.5C（g/L）

如血浆纤维蛋白原含量大于4 g/L时，应稀释血浆后重测，结果乘以稀释倍数。低于0 如血浆纤维蛋白原含量大于4 g/L时，应稀释血浆后重测，结果乘以稀释倍数。低于0.8 g/L时，需将原血浆改为1∶2或1∶5稀释，在标准曲线上查得结果后，除以5或除以2。

正常参考值： 2～4mg/ml

临床意义： 纤维蛋白原增高除生理情况下的应激反应、妊娠后期外，主要出现感染、灼伤、动脉粥样硬化、急性心肌梗死、多发性骨髓瘤、糖尿病、败血症等。 纤维蛋白原减少见于DIC、原发性纤溶亢进症、重症肝炎、肝硬化和溶栓治疗时。

评价： Clauss方法测定的是纤维蛋白原功能，因此需纤维蛋白原结构正常，且有一定的含量，对低（无）纤维蛋白原血症和因此后纤维蛋白原血症应改用ELISA和RIA等免疫检测手段。

主要误差来源： 血浆稀释不准。 凝血酶活性不足或失效。凝血酶一般应在低温保存，稀释后在塑料(聚乙烯)试管中，置4℃可保存活性24小时。 测定终点观察不准确，尤其是纤维蛋白原含量高时，往往很快即凝固，手工法重复性较差，不易做准。

血浆凝血酶时间TT

原理 以标准凝血酶溶液加入受检血浆，使凝血酶裂解血浆中的纤维蛋白原，形成纤维蛋白，造成血浆凝固，此时所需时间为凝血酶时间。

方法： 0.1ml血浆+0.1mlTT试剂，37℃水浴中观察凝固时间。

正常参考值： 16~18S

评价： 时间大于正常参考值3秒：DIC、肝脏病变。

TT时间缩短，并不代表高凝状态或DIC前期，是技术原因。如操作失误，组织液混入血标本，标本在4℃环境中放置过久。