吸光光度法基本原理 光度计及其基本部件 显色反应及显色条件的选择 吸光度测定条件的选择 吸光光度法的应用 紫外吸收光谱法简介
吸光光度法 基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法称之为吸光光度法。 包括 比色法 可见分光光度法 紫外分光光度法 红外光谱法
吸光光度法 可见吸收光谱：电子跃迁光谱，吸收光波长范围400750 nm ，主要用于有色物质的定量分析。
吸光光度法 特点 灵敏度高 适用于微量组分的测定 相对误差约为 2 %一 5 % 测定迅速 仪器操作简单 价格便宜 应用广泛
吸光光度法 / 吸光光度法基本原理 光的波段划分
吸光光度法 / 吸光光度法基本原理 物质对光的选择性吸收 当一束白光（由各种波长的光按一定比例组成）通过某一有色溶液时，一些波长的光被溶液吸收，另一些波长的光则透过。透射光（或反射光） 刺激人眼而使人感觉到颜色的存在。因此溶液的颜色由透射光的波长所决定。 能够组成白光的两种光称为补色光，两种颜色互为补色。
吸光光度法 / 吸光光度法基本原理 物质颜色与吸收光颇色的互补关系
吸光光度法 / 吸光光度法基本原理 M + 热 M + h M * M + 荧光或磷光 基态 激发态 E1 （△E） E2 当一束光照射到某物质或其溶液时，组成该物质的分子、原子或离子与光子发生“碰撞”，光子的能量被分子、原子所吸收，使这些粒子由最低能态（基态）跃迁到较高能态（激发态） M + 热 M + h M * M + 荧光或磷光 基态 激发态 E1 （△E） E2
吸光光度法 / 吸光光度法基本原理 物质对光的选择性吸收 分子、原子或离子具有不连续的量子化能级， 仅当照射光的光子能量与被照射物质粒子的基态和激发态能量之差相当时才能发生吸收。 不同的物质微粒由于结构不同而具有不同的量子化能级，其能量差也不相同。 所以物质对光的吸收具有选择性
吸光光度法 / 吸光光度法基本原理
吸光光度法 / 吸光光度法基本原理 以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图 吸收曲线（吸收光谱）----物质对不同波长光的吸收能力 的描述 最大吸收波长----同一种物质对不同波长光的吸光度不同。吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长λmax 不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似λmax不变 在吸收峰及附近处的吸光度随浓度增加而增大 而对于不同物质，它们的吸收曲线形状和λmax则不同
吸光光度法 / 吸光光度法基本原理
吸光光度法 / 吸光光度法基本原理 定性分析----不同物质其吸收曲线的形状和最大吸收波长各不相同。根据这个特性可用作物质的初步定性分析 定量分析---- 不同浓度的同一物质，在吸收峰及附近处的吸光度随浓度增加而增大。根据这个特性可对物质定量分析。若在最大波长处侧定吸光度，则灵敏度最高。 吸收曲线是吸光光度法定量分析时选择测定波长的重要依据。
朗伯阐明了光的吸收程度和吸收层厚度的关系。A∝b 吸光光度法 / 朗伯一比尔定律 朗伯阐明了光的吸收程度和吸收层厚度的关系。A∝b （朗伯动画1） 比耳提出了光的吸收程度和吸收物浓度之间也具有类似的关系。A∝ c （比耳动画2） 二者的结合称为朗伯—比耳定律，其数学表达式为：
吸光光度法 / 朗伯一比尔定律 A＝lg（I0/It)= k b c b：液层厚度(光程长度)，通常以cm为单位； c：溶液的摩尔浓度，单位mol·L－１； k：摩尔吸光系数，单位L·mol－１·cm－１； 或: A＝lg（I0/It)= a b c c：溶液的浓度，单位g·L－１ a：吸光系数，单位L·g－１·cm－１ a与k的关系为： a =k / M （M为摩尔质量）
吸光光度法 /朗伯一比尔定律 /透光度(透光率)T T = I t / I0 吸光度A与透光度T的关系: A ＝ －lg T 摩尔吸光系数k在数值上等于浓度为1 mol/L、液层厚度为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度； 吸光系数a(L·g-1·cm-1）相当于浓度为1 g/L、液层厚度为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度。
吸光光度法 / 朗伯一比尔定律 朗伯一比尔定律不仅适用于溶液，也适用于其他均匀非散射的吸光物质（气体或固体），是各类吸光光度法定量分析的依据 K 可作为定性鉴定的参数，也可用以估量定量方法的灵敏度：K 值愈大，方法的灵敏度愈高。由实验结果计算 K 时，常以被测物质的总浓度代替吸光物质的浓度，这样计算的 K 值实际上是表观摩尔吸收系数。
吸光光度法 / 朗伯一比尔定律
吸光光度法 / 朗伯一比尔定律/ 吸光度的加和性 在多组分体系中，如果各种吸光物质之间没有相互作用，这时体系的总吸光度等于各组分吸光度之和，即吸光度具有加和性
吸光光度法 /偏离比尔定律的原因 在吸光光度分析中，经常出现标准曲线不呈直线的情况，特别是当吸光物质浓度较高时，明显地看到通过原点向浓度轴弯曲的现象(吸光度轴弯曲)。 这种情况称为偏离朗伯-比尔定律。若在曲线弯曲部分进行定量，将会引起较大的误差。
吸光光度法 /偏离比尔定律的原因 非单色光引起的偏离 朗伯-比尔定律只适用于单色光，但由于单色器色散能力的限制和出口狭缝需要保持一定的宽度，所以目前各种分光光度计得到的入射光实际上都是具有某一波段的复合光。由于物质对不同波长光的吸收程度的不同，因而导致对朗伯－比尔定律的偏离。
吸光光度法 /偏离比尔定律的原因 /非单色光引起的偏离
吸光光度法 /偏离比尔定律的原因 /非单色光引起的偏离
吸光光度法 /偏离比尔定律的原因 /非单色光引起的偏离
吸光光度法 /偏离比尔定律的原因 /非单色光引起的偏离 克服非单色光引起的偏离的措施 使用比较好的单色器，从而获得纯度较高的 “单色光”，使标准曲线有较宽的线性范围。 人射光波长选择在被测物质的最大吸收处，保证测定有较高的灵敏度，此处的吸收曲线较为平坦，在此最大吸收波长附近各波长的光的k 值大体相等，由于非单色光引起的偏离要比在其他波长处小得多。 测定时应选择适当的浓度范围，使吸光度读数在标准曲线的线性范围内。
吸光光度法 /偏离比尔定律的原因 /化学因素引起的偏离 浓度 高浓度时（通常＞ 0 . 01 mol / L ）由于吸光粒子间的平均距离减小，以致每个粒子都可影响其邻近粒子的电荷分布，这种相互作用可使它们的吸光能力发生改变。由于相互作用的程度与浓度有关，随浓度增大，吸光度与浓度间的关系就偏离线性关系。所以一般认为比尔定律仅适用于稀溶液。 溶液中的吸光物质常因解离、缔合、形成新化合物或互变异构等化学变化而改变其浓度，因而导致偏离朗伯—比尔定律。 解离 大部分有机酸碱的酸式、碱式对光有不同的吸收性质，溶液的酸度不同，酸(碱)解离程度不同，导致酸式与碱式的比例改变，使溶液的吸光度发生改变。 配合 显色剂与金属离子生成的是多级配合物，且各级配合物对光的吸收性质不同，例如在Fe(Ⅲ)与SCN-的配合物中，Fe(SCN)3颜色最深，Fe(SCN)2+颜色最浅，故SCN-浓度越大，溶液颜色越深，即吸光度越大。
吸光光度法 /偏离比尔定律的原因 /化学因素引起的偏离 铬酸盐或重铬酸盐溶液中存在下列平衡： CrO42- ＋2H＋ = Cr2O72- ＋H2O 溶液中CrO42-、 Cr2O72-的颜色不同，吸光性质也不相同。故此时溶液pH 对测定有重要影响。