名以清修 利以义制 绩以勤勉 汇通天下 新晋商理念 李安平 名以清修 利以义制 绩以勤勉 汇通天下 新晋商理念。从97年开始振东就一直以名以清修、利以义制、绩以勤勉、汇通天下来奋斗。我们要让我们的产品汇通天下。 李安平

培训教材： 无菌检查方法验证 韩佩莲 山西振东泰盛制药有限公司

无菌检查法 系用于检查要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料、及其 他品种是否无菌的一种方法。

验证目的 以证明所采用的方法适合于该产品的无菌检查，保证检验结 果的可靠性。

何时验证 当建立产品的无菌检查法时； 若该产品的组分或原检验条件发生改变时。

无菌检查法 设备及用具 参照《中国药典》2010版附录无菌检查法方法 培养基 硫乙醇酸盐流体培养基 改良马丁培养基

无菌检查法 检查方法： 薄膜过滤法 ；直接接种法 大取样量，不易漏检，仪器操作简单； 全封闭过滤系统，避免了外源性细菌的污染。 薄膜过滤法 ；直接接种法 大取样量，不易漏检，仪器操作简单； 全封闭过滤系统，避免了外源性细菌的污染。 只要供试品性状允许，应尽量采用薄膜过滤法！

验证用菌株 无菌检查项目 薄膜过滤法 验证用菌 直接接种法 金黄色葡萄球菌 √ 大肠埃希菌 铜绿假单胞菌 -- 生孢梭菌 白色念珠菌 黑曲霉

无菌检查法验证 1、制备各试验菌菌液 将规定需用的试验菌分别制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。 2、供试液的制备 用溶解、乳化、破乳、稀释、离心等方法，或几种方法联用，将样品制成均匀的供试液。

无菌检查法验证 3、验证试验 试验组——供试液+小于100cfu菌 薄膜过滤法：最后一次冲洗时加入；或保 证滤膜完整情况下，在最终培养体系中加入。 直接接种法：直接加入。 阳性对照组——等量试验菌

无菌检查法验证 4、结果判断 阳性对照组 试验组 结论 生长良好 该法适用于供试品检验 生长缓慢或者不生长 该检验量、检验条件下存在抑菌作用

无菌检查法验证 5、抑菌作用的消除(或抑制)方法 ①中和法 & ②薄膜过滤法 薄膜过滤法 消除抑菌作用的方法 直接接种法 √ ①中和法 & ②薄膜过滤法 薄膜过滤法 消除抑菌作用的方法 直接接种法 √ 稀释剂中添加中和剂、灭活剂、表面活性剂 培养基中添加中和剂、灭活剂、表面活性剂 增加冲洗液用量 -- 更改冲洗液种类 更换滤膜材质

无菌检查法验证 ①中和法 选用一定的化学中和剂，加入具抑菌作用的产品中可方便快 捷地中和抑菌剂，消除抑菌作用。 注意：中和剂消除抑菌作用的同时，会对微生物由轻微伤害 根据检品抑菌作用的大小和药典的要求，设计方案，通过试 验确认化学剂的浓度、加量及其他有关检验条件。

无菌检查法验证 干扰物 可选用的中和剂或灭活方法 戊二醛 亚硫酸氢钠 醛类 甘氨酸、硫代硫酸盐 季铵类化合物（QACa）、对羟基苯甲酸酯 卵磷脂、聚山梨酯 汞类制剂 亚硫酸氢钠、巯基乙酸盐、硫代硫酸盐 双胍类化合物 卵磷脂 碘酒、洗必泰类 聚山梨酯 卤化物 硫代硫酸盐 乙二胺四乙酸 镁或钙离子 磺胺类 对氨基苯甲酸 Β-内酰胺类抗生素 Β-内酰胺酶 金属盐类 巯基化合物（巯乙醇酸钠、L-胱氨酸） 脂溶性药物 表面活性剂（如吐温-80）

无菌检查法验证 中和法消除抑菌性方法的验证： 试验方法： 样品组——供试液+抑菌中和剂+试验菌（<100CFU） 对照组——用0.1%蛋白胨溶液代替供试液，其余同

无菌检查法验证 样品组 菌种活性检查组——不加抑菌中和剂，将试验菌直接接种 结果： 样品组与对照组计数相似——中和剂有效中和 对照组与菌种活性检查组计数相似——中和剂毒性不影响微 生物生长（或检出）

无菌检查法验证 5、抑菌作用的消除(或抑制)方法 ②薄膜过滤法——微生物检验中，尤其无菌检查中常用消除 产品抑菌性的方法。 原理：抑菌产品通过滤膜时，微生物被截留在滤膜上，具抑 菌作用的成分被滤掉，滤后转移至适合培养基中培养，观察 结果降低滤膜上残留抑菌剂。

无菌检查法验证 抑菌作用的方法： 使用低吸附性的滤膜； 稀释防腐剂或淋洗滤膜； 淋洗液中加入适量化学中和剂。

无菌检查法验证 薄膜过滤法消除抑菌性方法的验证 样品组：供试品经过滤后，用稀释中和液淋洗滤膜两次，每 次100mL。淋洗两次后，再另外100mL淋洗液中介入对照菌 （<100cfu）。 将滤膜转移至适当培养基中培养。 对照组：以0.1%的蛋白胨溶液取代供试品，其余同样品组。

无菌检查法验证 菌种活性检查组：接种等量试验菌至固体培养基上 结果： 样品组与对照组结果相似——验证通过 样品组微生物生长不明显——抑菌作用去除不够充分，更改 实验条件，重新验证

无菌检查法验证流程 培养基的配制 稀释剂 菌液制备 供试液的制备 阴性对照 试验组 +<100 CFU 培养 （—） 生长良好 阳性对照组 阴性对照 ①增加冲洗液用量 ②更改冲洗液种类 ③更换滤膜材质 试验组 +<100 CFU ①中和剂、 ②灭活剂、 ③表面活性剂 过滤 培养 （—） 生长良好 生长缓慢、不生长

无菌检查法验证流程 培养基的配制 稀释剂 菌液制备 阴性对照 供试液的制备 试验组 +<100 CFU 过滤 培养 （—） 生长良好 阳性对照组 试验组 +<100 CFU 过滤 培养 （—） 生长良好 生长良好 依此法检验进行供试品的无菌检查！

头孢噻肟钠无菌原料的无菌实验方法验证 样品：头孢噻肟钠无菌原料 规格：0.5g/瓶；批号：40807001 生产单位：Aventis Pharma Deutschland GmbH 培养基：硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基、营养肉 汤、普通斜面、真菌斜面、营养琼脂、玫瑰红钠琼 脂（均由中国药品生物制品检定所培养基室提供)

头孢噻肟钠无菌原料的无菌实验方法验证 β-内酰胺酶 2mL，大于300单位/毫升，批号：20030630 仪器和滤器 HTY-2000A集菌仪 全封闭无菌试验过滤培养器（批号20050105）北京牛牛基因 有限公司。

(1)金黄色葡萄球菌(Staphylococcu saureus) [CMCC(B) 26003] 验证用菌种 (1)金黄色葡萄球菌(Staphylococcu saureus) [CMCC(B) 26003] (2)枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B) 63501] (3)大肠埃希菌 (Escherichia coli) [CMCC(F) 44102] (4)铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC(B) 10104] (5)生孢梭菌(Clostridium sporogenes) [CMCC(B) 64941] (6)白色念珠菌 (Candida albicans) [CMCC(F) 98001] (7)黑曲霉 (Aspergillus niger) [CMCC(F) 98003]

操作方法 1、菌液制备 生孢梭菌 白色念珠菌 黑曲霉 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 大肠埃希菌 铜绿假单胞菌 营养肉汤培养基 ℃ h 取1mL +生理盐水 稀释至 50~100 cfu/mL 硫乙醇酸盐流体培养基 ℃ h 取1mL +生理盐水 稀释至 50~100cfu/mL 生孢梭菌 改良马丁培养基 ℃ h +生理盐水 吸出孢子至 空管 取1mL 50~100cfu/mL 白色念珠菌 改良马丁培养基 ℃ h +生理盐水 吸出孢子至 空管 取1mL 50~100cfu/mL 黑曲霉

操作方法 2、菌液计数 细菌：分别取上述5种细菌菌液1mL加入培养皿，每种菌液做平行2皿。注入营养琼脂约18mL。30~35℃培养（生孢梭菌置厌氧培养箱中培养）。 真菌：分别取上述2种真菌菌液1mL加入培养皿，每种菌液做平行2皿。注入玫瑰红钠琼脂约18mL。23~28℃培养。 3、供试液制备 每2支以100mL生理盐水溶解，混匀备用。

操作方法 4、薄膜过滤法 试验组：将规定量的供试品按薄膜过滤法过滤，冲洗，每次50mL，在最 后一次的冲洗液中逐一加入少于100 CFU的试验菌。按规定将培养基直 接加至滤筒内（细菌各加硫乙醇酸盐流体培养基100 mL，真菌各加改良 马丁培养基100 mL ）。 阳性对照：另取滤筒，不过滤供试品，其它操作同上，作为阳性对照。 阴性对照：两个滤器桶内各过滤生理盐水200mL，然后分别加入硫乙醇 酸盐培养基和改良马丁培养基各100mL，不加对照菌液。

操作方法 5、培养 硫乙醇酸盐流体培养基桶30-35℃培养~3天；改良马丁培养基桶23-28℃培养~5天，每天观察并记录结果。 6、结果判定 菌落计数结果见表1和表2； 试验结果见表3和表4。

22 26 36 39 62 66 58 54 20 24 38 64 56 83 表1 细菌数计数 菌 种 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 表1 细菌数计数 菌 种 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 铜绿假单胞菌 生孢梭菌 计数(CFU) 22 26 36 39 62 66 58 54 20 均值(CFU) 24 38 64 56 表2 真菌数计数结果 菌 种 黑曲霉菌 白色念珠菌 计数(CFU) 86 93 83 均值(CFU) 89 85

表3 细菌实验结果 (20小时观察) 冲洗量 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 铜绿假单胞菌 生孢梭菌 冲洗量800ml 表3 细菌实验结果 (20小时观察) 冲洗量 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 铜绿假单胞菌 生孢梭菌 冲洗量800ml 72h( - ) + 冲洗量1000ml   阳性对照

表4 36小时观察真菌结果 冲洗量 黑曲霉菌 白色念珠菌 冲洗量200ml + 冲洗量400ml 阳性对照

操作方法 7、中和法+稀释法消除抑菌性 由表3结果可知，大肠埃希菌为本样品的敏感菌 β-内酰胺酶处理，同时增加冲洗液用量 试验组：取12支样品，每2支以10mL生理盐水溶解，6个过滤桶内分别冲洗300mL、500mL、800mL生理盐水各二桶，每次100mL，各加入硫乙醇酸盐培养基100mL和β-内酰胺酶2支。分别加入大肠杆菌菌液（肉汤培养物10倍稀释至10-7）1mL。 阳性对照组：大肠杆菌菌液（肉汤培养物10倍稀释至10-7 ）1mL。

8、消除抑菌性验证试验结果判定 培养时间 14h 25h 38h 110h 冲洗量300mL - 冲洗量500mL + 冲洗量800mL 阳性对照

9、结论 头孢噻肟钠无菌原料无菌检查法: 取样量3.0克，采用薄膜过滤法（封闭滤器为北京牛牛基因技术有限公司生产）。 冲洗液为0.9％的氯化钠溶液，冲洗量800mL，加β-内酰胺酶酶量2支（大于300单位/mL），以大肠埃希菌为阳性对照菌。

谢 谢 大 家！