医学细胞生物学实验 小鼠骨髓细胞染色体标本的制备与观察 徐志浩 15294858210 遗传与基因工程教研室 院系楼西侧一楼 2016年

医学细胞生物学实验 实验目的 掌握小鼠骨髓细胞染色体标本制备的原理和方法； 掌握小鼠骨髓细胞染色体的基本特征。

实验原理 染色体是染色质在细胞分裂期的存在形式。细胞分裂中期，染色体在赤道板上排列清晰，是染色体观察的最佳时期。 医学细胞生物学实验 实验原理 染色体是染色质在细胞分裂期的存在形式。细胞分裂中期，染色体在赤道板上排列清晰，是染色体观察的最佳时期。 怎样才能制备一个好的染色体标本？ 获得大量处于有丝分裂中期的细胞。 使细胞破裂，且染色体能够完整并较分散的释放出来。

实验原理 骨髓细胞：细胞数量较多，取材方便，具有高度分裂能力和较强的分裂活性，可直接观察到分裂细胞，是研究动物细胞遗传学的好材料。 医学细胞生物学实验 实验原理 骨髓细胞：细胞数量较多，取材方便，具有高度分裂能力和较强的分裂活性，可直接观察到分裂细胞，是研究动物细胞遗传学的好材料。 秋水仙素：可以抑制细胞分裂时的纺锤体形成，使处于增殖状态的细胞停止在有丝分裂中期。注射到动物活体内，可以富集到较多的中期分裂相的骨髓细胞。 低渗：使细胞吸水膨胀，增加细胞膜的脆性。固定：维持细胞形态并消除染色体周围的杂蛋白。 悬空滴片：破碎细胞，染色体贴附在载玻片上。 这种骨髓染色体制片方法简单，取材容易，不需无菌条件，方便易行。

医学细胞生物学实验 试剂 100μg/ml秋水仙素：秋水仙素5mg，加5ml灭菌的生理盐水，即成1mg/ml秋水仙素溶液，于冰箱中闭光保存备用，使用时可用生理盐水稀释到100μg/ml固定液； 甲醇：冰醋酸=3：1（现配现用）； 低渗液：0.075mol/L KCl（提前37℃预热）； Giemsa染液工作液：Giemsa原液用磷酸缓冲液（pH6.8）稀释（1：10） （工作液现配现用）。

操作步骤 关键步骤：秋水仙素处理、低渗、单细胞悬液制备、滴片 医学细胞生物学实验 关键步骤：秋水仙素处理、低渗、单细胞悬液制备、滴片 1、动物预处理：取材前3~4h，按每克体重2~4μg腹腔注射100μg/ml的秋水仙素。 5、固定：弃上清，再加 固定液至5ml，吹打混匀，室温固定20分钟，离心同上。弃上清液，加0.2~0.4ml固定液，混匀成单细胞悬液。 2、收集骨髓细胞：颈椎脱臼法处死小鼠，解剖取出股骨，用纱布剔除肌肉，剪掉股骨两端，用带针头注射器吸取8ml低渗液，冲取骨髓细胞至离心管中，反复冲洗直至骨髓腔变白为止。 6、滴片：取预先冰冻的干净载玻片，在≥30cm的高度，滴上2~3滴细胞悬液，向同一方向吹气，使细胞分散均匀，迅速在酒精灯上快速烤干，不要过热。 秋水仙素用量要注意,太多或处理时间过长，会导致染色体的过分凝缩或着丝点裂解，最终会引起染色体形态不正常，甚至被破坏或溶解。 低渗处理很关键。低渗液的量、处理时间均与细胞的数量有关。低渗过度，细胞会破裂；低渗不足则染色体在一起，分散不开。 4) 离心速度或离心时间也能影响染色体标本的制备。离心速度过大或离心时间过长，则会引起细胞破裂；反之，离心速度过小或离心时间过短，则细胞沉降不下来，则会引起大量细胞的丢失。 5) 固定液要随用随配，固定彻底后再打散细胞团块，否则细胞容易破碎，染色体分散亦受到影响。 6) 载玻片要预冷.冷却不够，则会影响染色体的附着和铺展。 7) 用吸管吹散细胞时用力必须尽量轻柔，用力过大则会造成细胞破裂，而染色体也会弥散在溶液中，在随后的离心中将会丢失。 8) 滴片时的高度很重要，高度过低细胞不会破裂；过高则染色体过于分散甚至丢失，无法辨别出染色体的准确数量。 把动物细胞置于低渗液（如低浓度的KCl溶液或蒸馏水）中，使动物组织细胞充分吸水膨胀，染色体分散，平整地铺展在载玻片上，再用火焰干燥让染色体紧贴在载玻片上。这就是低渗火焰干燥法。此法有效地克服了压片法中存在的染色体分散不开、平展不良等的不足 预固定：终止低渗； 固定：杀死细胞，停止增值，防止离心时细胞间的相互粘连 低渗液是指渗透压和离子强度均低于正常细胞生理条件的溶液，例如水、低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾（0.65M）、氯化钾（0.075M）等。低渗效果取决于低渗液的化学组成、低渗的温度和处理时间。低渗处理是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展，同时可使粘附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态。实验室中一般选用0.075M KCl为低渗液（具体情况取决于实际操作），其优点有：①染色体轮廓清楚，可染色性强，染色时间短，②用于显带染色时能充分显示带型特点。低渗处理为37℃，15－25分钟，以预实验条件为准。 冰冻的冷载玻片：细胞从高空坠落，碰到玻片破裂，遇冷细胞膜更易破裂使染色体散出 3、低渗处理：用吸管轻轻吹打成细胞悬液，置37℃低渗30min，中间吹打一次。 4、预固定：加1ml固定液（现配现用），吹打混匀，1000rpm离心8分钟。（终止低渗） 7、染色镜检： Giemsa染液染色8~10min，用缓慢的流水冲洗去多余染液，晾干，显微镜下观察。

医学细胞生物学实验 小鼠腹腔给药

颈椎脱臼法 在蜡盘中操作 固定颈部，斜向上30-45o 拉伸尾巴。 医学细胞生物学实验 小鼠一般不会咬人，但取用时动作也要轻缓。 先用右手抓住鼠尾提起，放在实验台等粗糙表面，在其向前爬行时，用左手的拇指和食指抓住小鼠的两耳和头颈部皮肤。

医学细胞生物学实验 颈椎脱臼法

医学细胞生物学实验 股骨

医学细胞生物学实验

医学细胞生物学实验 股骨头

医学细胞生物学实验 股骨头

收集骨髓细胞 沿虚线剪去两端股骨头，暴露骨髓腔，再用注射器吸取低渗液冲洗骨髓。 反复冲洗。 至骨髓腔发白为止。 收集到离心管中。 医学细胞生物学实验 收集骨髓细胞 沿虚线剪去两端股骨头，暴露骨髓腔，再用注射器吸取低渗液冲洗骨髓。 反复冲洗。 至骨髓腔发白为止。 收集到离心管中。

医学细胞生物学实验

医学细胞生物学实验 滴片、烤片 冰片：黏连性、延展性 悬空滴片 滴1~2滴于玻片上，吹气 在酒精灯火焰过火2~3次，勿过热。 预冷的冰片

医学细胞生物学实验 离心机

离心机的使用方法 离心机水平放置。 检查：调速旋钮是否处在零位，套管是否完整无损和垫有橡皮垫。 配平离心管。 医学细胞生物学实验 离心机的使用方法 离心机水平放置。 检查：调速旋钮是否处在零位，套管是否完整无损和垫有橡皮垫。 配平离心管。 等质量对称放置离心管，转头拧紧，盖紧盖子。 打开电源，调节离心时间，最后缓慢调节转速，离心过程中需要人员值守。 待离心机自行减速停止转动后，方可打开盖子，取出离心样品后要避免晃动离心管。 清扫并保养。

医学细胞生物学实验 小鼠骨髓染色体标本 将制好的玻片置于显微镜下，首先观察标本的制备效果，检验操作过程是否正确。一般来说，制得好的标本应是细胞多、颜色为紫红色。此时间期细胞由于低渗和固定处理，细胞膜和质已被去掉，镜下看到的仅为膨胀后呈圆形的细胞核。分裂期细胞染色体集中在一起，其外也无细胞膜包裹，染色体之间无重叠，易分辨，臂的长度适中。但最重要的是分裂相要多。分裂相的多少主要取决于秋水仙素的用量和时间。秋水仙素还影响染色体的形态，如用量过大，常使染色体过于缩短，不利于观察。 小白鼠的染色体数目（2n）为40条，但全部为端着丝粒染色体，大小区别不明显，较难分组编号，一般为“U”、“V”形

医学细胞生物学实验 小鼠骨髓染色体标本

医学细胞生物学实验 小鼠骨髓染色体核型特征 2n=40 端着丝粒染色体，U型或V型

注意事项 掌握好秋水仙素的浓度和处理时间； 离心需要配平； 小鼠骨髓要冲洗干净，以收集足够的骨髓细胞； 低渗处理是实验成败的关键，注意低渗时间； 固定液要现配现用，固定要充分； 载玻片要洁净并预冷，滴片要有一定的高度； 细胞悬液不能太稀，要呈乳白色； 烤片时温度不能太高。 秋水仙素用量要注意,太多或处理时间过长，会导致染色体的过分凝缩或着丝点裂解，最终会引起染色体形态不正常，甚至被破坏或溶解。 低渗处理很关键。低渗液的量、处理时间均与细胞的数量有关。低渗过度，细胞会破裂；低渗不足则染色体在一起，分散不开。 4) 离心速度或离心时间也能影响染色体标本的制备。离心速度过大或离心时间过长，则会引起细胞破裂；反之，离心速度过小或离心时间过短，则细胞沉降不下来，则会引起大量细胞的丢失。 5) 固定液要随用随配，固定彻底后再打散细胞团块，否则细胞容易破碎，染色体分散亦受到影响。 6) 载玻片要预冷.冷却不够，则会影响染色体的附着和铺展。 7) 用吸管吹散细胞时用力必须尽量轻柔，用力过大则会造成细胞破裂，而染色体也会弥散在溶液中，在随后的离心中将会丢失。 8) 滴片时的高度很重要，高度过低细胞不会破裂；过高则染色体过于分散甚至丢失，无法辨别出染色体的准确数量。 把动物细胞置于低渗液（如低浓度的KCl溶液或蒸馏水）中，使动物组织细胞充分吸水膨胀，染色体分散，平整地铺展在载玻片上，再用火焰干燥让染色体紧贴在载玻片上。这就是低渗火焰干燥法。此法有效地克服了压片法中存在的染色体分散不开、平展不良等的不足 预固定：终止低渗； 固定：杀死细胞，停止增值，防止离心时细胞间的相互粘连 低渗液是指渗透压和离子强度均低于正常细胞生理条件的溶液，例如水、低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾（0.65M）、氯化钾（0.075M）等。低渗效果取决于低渗液的化学组成、低渗的温度和处理时间。低渗处理是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展，同时可使粘附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态。实验室中一般选用0.075M KCl为低渗液（具体情况取决于实际操作），其优点有：①染色体轮廓清楚，可染色性强，染色时间短，②用于显带染色时能充分显示带型特点。低渗处理为37℃，15－25分钟，以预实验条件为准。 冰冻的冷载玻片：细胞从高空坠落，碰到玻片破裂，遇冷细胞膜更易破裂使染色体散出

医学细胞生物学实验 染色体标本的制备的应用 染色体标本的观察广泛应用于一些疾病的临床诊断中。例如白血病、恶性血液病等的诊断，也可用于观察毒性物质对机体遗传物质——染色体损伤的状况。

医学细胞生物学实验

医学细胞生物学实验

作业 简述小鼠骨髓细胞染色体标本制备的原理和操作过程。 医学细胞生物学实验 作业 简述小鼠骨髓细胞染色体标本制备的原理和操作过程。 绘制小鼠骨髓染色体核型示意图。如果没有观察到有丝分裂中期分裂相的染色体，请解释实验失败的原因。