医学细胞生物学实验 细胞冻存复苏技术 与细胞计数 徐志浩 遗传与基因工程教研室 院系楼西侧一楼 2016年
实验目的 实验原理 掌握细胞冻存与复苏的原理。 熟悉细胞冻存复苏的一般操作过程。 掌握细胞计数的一般方法。 细胞冻存的必要性 冻存温度 医学细胞生物学实验 实验目的 掌握细胞冻存与复苏的原理。 熟悉细胞冻存复苏的一般操作过程。 掌握细胞计数的一般方法。 实验原理 细胞冻存的必要性 冻存温度 冻存操作对细胞的损伤：冰晶损伤、溶液损伤 冻存保护剂 冻存复苏的原则：慢冻速融
医学细胞生物学实验 1、细胞冻存 1ml鸡血+1ml生理盐水→1500rpm离心5min(配平)→弃上清→加2ml冻存液→混匀 (空气吹打法) →分装至1ml的冻存管→标记→液氮罐口（-60~-70 ℃ ）10min →液氮中冻存10min （-196℃ ）。 无菌操作; 保护剂； 细胞浓度； 梯度降温（慢冻）； 防止冻伤； 防爆； 冻存管做好标记。
2、细胞复苏与计数 如何区别死细胞和活细胞？ 医学细胞生物学实验 2、细胞复苏与计数 取出冻存管→ 37℃水浴1min融化→转入离心管→加至5ml培养液→混匀→ 1500rpm离心5min→弃上清→加1ml培养液→混匀→取0.5ml →加入等体积台盼蓝→染色1min →计数 → 计算细胞活力和细胞浓度。 细胞活力（率）：活细胞所占的比率。 如何区别死细胞和活细胞？
3、细胞计数板的使用 0.1mm3 10-4ml 计数之前熟悉计数板构造并熟练掌握计数方法。 使用计数板前用酒精棉球轻轻擦拭干净。 医学细胞生物学实验 3、细胞计数板的使用 7.5cm 1mm 1mm 3.5cm 0.1mm3 0.1mm 10-4ml 计数之前熟悉计数板构造并熟练掌握计数方法。 使用计数板前用酒精棉球轻轻擦拭干净。 先盖盖玻片，再滴细胞悬液。 压线细胞：计上不计下、计左不计右。 计数方向：按一定顺序。
细胞浓度(个/ml)= 四大格总细胞数 ×104 ×N(稀释倍数) 4 细胞活力(率)= 四大格活细胞数 ×100% 四大格总细胞数 医学细胞生物学实验 细胞浓度(个/ml)= 四大格总细胞数 ×104 ×N(稀释倍数) 4 细胞活力(率)= 四大格活细胞数 ×100% 四大格总细胞数 复苏细胞活力影响因素 冻存复苏操作。 染色时间。 计数时间。
医学细胞生物学实验 作业 列出细胞冻存与复苏的主要操作步骤。 计算细胞浓度和细胞活力，并分析影响细胞活力的原因。