种子检验学实验 种子检验学 马守才 博士/副教授 西北农林科技大学农学院 马守才 博士/副教授 西北农林科技大学农学院 Email:mashoucai@nwsuaf.edu.cn
实验三 ISTA小麦种子醇溶蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定品种纯度 一、目的要求 (1)了解种子醇溶蛋白酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定品种的原理。 (2)掌握具体电泳方法。
二、实验原理 从种子中提取的醇溶蛋白在聚丙烯酰胺凝胶的分子筛效应和电泳分离的电荷效应组成作用下得到良好的分离，通过显色显示蛋白质谱带类型。不同品种由于遗传不同，种子内所含的蛋白质种类有差异，这种差异可利用电泳图谱加以鉴别，从而对品种真实性和纯度进行鉴定。 3
三、材料和用具 （见实验过程） 四、方法和步骤 1．样品醇溶蛋白提取 逐粒磨碎小麦种子样品，放入离心管 三、材料和用具 （见实验过程） 四、方法和步骤 1．样品醇溶蛋白提取 逐粒磨碎小麦种子样品，放入离心管 然后加入样品提取液，每管小麦加入0.5mL 室温下将其浸提一夜 加样前用5 500r／min，离心15 min。 4
加入15 μL 10％APS和5 μL TEMED，迅速摇匀，倒入凝胶玻板之间，马上插好样品梳。 2．安装制胶器 3．灌制分离胶和插入样品梳 吸取凝胶液20 mL，放入烧杯; 加入15 μL 10％APS和5 μL TEMED，迅速摇匀，倒入凝胶玻板之间，马上插好样品梳。 5
小心平衡地拨出样品梳，然后用微量进样器吸取醇溶蛋白提取液。6-10ul 4．加样 小心平衡地拨出样品梳，然后用微量进样器吸取醇溶蛋白提取液。6-10ul 6
将电极缓冲液稀释10倍。取80mL电极缓冲原液，加无离子水稀释到800mL，分别注入前槽和后槽。 5．电泳 将电极缓冲液稀释10倍。取80mL电极缓冲原液，加无离子水稀释到800mL，分别注入前槽和后槽。 正极接上槽（短板），负极接下槽（长板），打开电泳仪，调节电压为500 V，开始电泳。醇蛋白电泳时间为甲基绿迁移时间的2～2.5倍。 7
在固定和染色前，按每块胶板吸取3.5 mL 1.0％考马斯亮蓝液，再加上100ml 10％三氯醋酸液，配成染色液。 6．固定和染色 在固定和染色前，按每块胶板吸取3.5 mL 1.0％考马斯亮蓝液，再加上100ml 10％三氯醋酸液，配成染色液。 小心地剥下胶板，并切去胶板一小角以做左右标记，然后用无离子水漂洗后，浸入染色液染色1—2d。 8
按电泳胶板蛋白质显色的蓝色谱带绘下电泳图谱，并计算出Rf值，与其品种的标准图谱比较，以鉴别品种的真伪。 7、电泳图谱鉴定 1.真实性鉴定 按电泳胶板蛋白质显色的蓝色谱带绘下电泳图谱，并计算出Rf值，与其品种的标准图谱比较，以鉴别品种的真伪。 2．品种纯度测定 按品种标准图谱别出图谱不同的异品种种子粒数，计算出品种纯度百分率。 9
五、作业 1. 参试小麦品种的真实性及其纯度。 2. 分析参试小麦品种间的差异。 10
（2）电极缓冲原液：量取20mL冰醋酸，称取2g甘氨酸，加无离子水，置于500mL容量瓶中定容，低温保存，使用时可稀释10倍或20倍。 试剂配置： （1）小麦种子醇溶蛋白提取液：称取0.05g甲基绿粉剂置于烧杯中，向其中加入2-氯乙醇25mL，加无离子水溶解，置于100mL容量瓶中定容，低温保存。 （2）电极缓冲原液：量取20mL冰醋酸，称取2g甘氨酸，加无离子水，置于500mL容量瓶中定容，低温保存，使用时可稀释10倍或20倍。 11
（3）凝胶缓冲液：量取10mL冰醋酸，称取0.5g甘氨酸，加无离子水溶解，容量瓶定容至500mL，低温保存。 12
（3）凝胶缓冲液：量取10mL冰醋酸，称取0.5g甘氨酸，加无离子水溶解，容量瓶定容至500mL，低温保存。 （4）凝胶溶液： 丙烯酰胺 48.1g 亚甲基丙烯酰胺 1.9g 尿素 12g 抗坏血酸 0.5g 硫酸亚铁 0.005g 加凝胶缓冲液定容至500mL，低温保存。 13
10%三氯乙酸溶液：称取50g的三氯乙酸，加无离子水定容至500mL （5）固定液和染色液 10%三氯乙酸溶液：称取50g的三氯乙酸，加无离子水定容至500mL 1%考马斯亮蓝溶液：称取0.5g考马斯亮粉剂，50mL无水乙醇溶解，搅拌过夜。 3.5mL1%的考马斯亮蓝溶液 染色液： 100mL 10%的三氯乙酸溶液 加凝胶缓冲液定容至500mL，低温保存。 14
（6）10%过硫酸铵（APS）：称取1g过硫酸铵，加无离子水10mL溶解，低温保存，且要现用现配。 15