102年度「產業人才扎根計畫」表面處理學程-「實務習作」成果海報 多層殼核形式之聚乙烯亞胺複合磷酸鈣奈米顆粒作為高效率非病毒基因載體之研究 大同大學材料系 102年度「產業人才扎根計畫」表面處理學程-「實務習作」成果海報 多層殼核形式之聚乙烯亞胺複合磷酸鈣奈米顆粒作為高效率非病毒基因載體之研究 劉俊宏 Chun-Hung Liu 指導教授：吳錫芩 Hsi-Chin Wu*（hcwu@ttu.edu.tw） 實驗介紹與目的 簡介：基因治療是一種嶄新且具有優勢的治療策略。基因載體的設計及材料選擇對轉染效率而言，佔有舉足輕重的地位。相較於病毒載體而言，非病毒載體（non-viral vector, NVV）於臨床上較無使用上之疑慮，但轉染效率低仍是有待克服的問題，因而使得目前研究趨向於開發具有高轉染率之NVV。磷酸鈣（calcium phosphate, CaP）是一種與天然骨頭基質相似的鹽類，已被發展為一種簡易製作且廣泛運用於體外的NVV，聚乙烯亞胺（Polyethyleneimine, PEI）已被開發為NVV之應用，藉由其所攜帶之正電性經由靜電吸引與具負電之pDNA緊密連結，同時亦能與帶負電之細胞膜相互吸引後增加進入細胞內的機率，PEI可經由質子海綿效應(Proton sponge effect)，有效提高目標基因進入細胞核來提高轉染率。 目的：開發PEI複合pDNA之CaP多層殼核形式之奈米顆粒做為NVV，可藉由內吞作用進入人類骨母細胞（ Human osteoblasts cell , HOB）內，經質子海綿效應將目標基因-質體DNA綠色螢光蛋白（plasmid DNA encoding enhanced green fluorescent protein, pEGFP）釋放於細胞質中進入細胞核，形成具有良好生物相容性及高轉染效率之新型NVV應用於骨組織再生修復。 實驗與方法 Material Test A B C Ca(NO3)‧4H2O CaP pDNA DLS FTIR TEM Transfection (NH4)2HPO4 Single CaP Ca2+ PO43- Figure2. 利用穿透式電子顯微鏡(TEM)觀察 （A）CaP ；（B） Tcap；（C）TCaP(PEI)之形態 Triple CaP(PEI) Triple CaP pDNA Double CaP PEI Table1. DLS分析CaP NP之ζ及顆粒尺寸分析 （表面為CaP(c) ；pDNA(p)；PEI (PEI)） Sample (pDNA) CaP(c) － SCaP(p) ＋ DCaP(c) TCaP(p) TCaP(PEI) Size (nm) 3869 299.1 351.1 448.5 140.2 Zeta (mV) -3.4 -34.1 -15.2 -24.3 +23.6 PDI 1 0.66 0.79 0.68 0.30 Figure3. 利用Fluorescence microscope(FM)觀察HOB細胞於 (A1-4)市售轉染劑LTX。(B1-4)單純DNA ；(C1-4)TCaP；(D1-4) TCaP(PEI) 轉染後1天之表現。（刻度尺為100 µm） Table2. 轉染HOB細胞之載體參數、轉染率與細胞活性分析 Sample PEI/ DNA(µg/mL) 轉染率(%) 細胞活性(%) LTX -/ 1 39.40±4.43 47.30±9.82 pEGFP -/ 30 30.26±3.02 65.00±4.04 TCaP -/6.94 50.33±3.84 59.4±2.35 TCaP(PEI) 3.47/ 3.47 59.26±5.21 52.2±2.45 Figure1. FTIR分析(A)TCaP(PEI)、(B)TCaP、 (C)CaP及(D)PEI之吸收峰值，可以發現磷酸根峰值(1030cm-1)隨多層核化後消失，且TCaP(PEI)在1638有胺基表現，顯示PEI表面改質成功。 結論 多層殼核結構之Cap NP可有效提升轉染效率。 以PEI進行表面改質之TCaP(PEI)載體，表面呈正電性 （+23.6 mV）、奈米尺寸大小（140 nm）且分散性佳。 TCaP(PEI)能成功攜帶pEGFP進入HOB表現綠螢光蛋白。 TCaP(PEI)具有良好之生物相容性且轉染效率佳（轉染率為59.3%），具有潛力做為新型NVV於未來基因治療之應用 Acknowledgement The authors thank for the funding support from NSC 102-2221-E-036-002-MY3, NSC 102-2815-C-036-001-E Tatung University B103-T02-018.