分子世界中實驗方法學的演進 楊倍昌 成大微生物暨免疫學研究所

https://www.facebook.com/DanDavidPrize/videos/10155496204991966/ "I think the question, of what is science, is one of the most fascinating ones in modern society."  More about the 2018 Laureate Professor Simon Schaffer who was awarded the Prize for the Past Time Dimension, History of Science alongside Prof. Lorraine Daston, and Prof. Evelyn Fox Keller.

現代科學家的刻板印象 有那些重點？這種印象的來源？

歷史中，有哪些創新的科學概念？ 更精確地說，我們可能必須拋棄｢典範的變遷，使科學家和跟科學家 學東西的人越來越接近真理｣這種想法。 這些作者都沒有面對一個問題：為什麼不同的作者會有不同的生物學 歷史時期的劃分方式。難道這些時期的劃分方式純粹是虛構的，因此 只能任由不同作者各自以不同的方式來建立？...我的看法並不是這樣 。這些劃分的時期並沒有普遍性、不普及才是主因。它們在不同的國 家有各自的發展，不同科學、不同的生物學次領域差異很明顯，特別 是“功能生物學與演化生物學”的差異更大。

近代生物學的奠基石 觀看的年代 (The era of observation)：1665-1884，世間繁花似錦。 分離提純的年代 (The era of isolation)：1864-1926，生命現象的新語言。 變化路徑的年代 (The era of pathway)：1933-1951，生產建築材料及生物能。 結構的年代 (The era of structure)：1934-1961，物性與結構。 預測與工程的年代 (The era of prediction and engineering)：1955-1985，掌控生命。 一、觀看的年代(The era of observation)：世間繁花似錦 1665 看見細胞 Hooke described plant cells and flea (Micrographia) 1677 看見原生物、細菌 Leeuwenhoek described firstly protists and bacteria living 1838 細胞學說 Schleiden & Schwan enunciated the cell theory 1857 物種起源 Darwin published the "The origin of species" 1863 細胞源自既有的細胞 Remak & Virchow defined the concept omnis cellula e cellula 1865 遺傳定律 Mendel reported the principles of heredity 1884 科霍病原假說 Koch & Loeffler proposed Koch’s postulate 二、分離提純的年代(The era of isolation)：生命現象的新語言 1864 血紅素蛋白結晶 Hoppe-Seyler first crystallized a protein: hemoglobin 1869 發現DNA Miescher discovered DNA 1893 證明酵素的催化性 Ostwald proved enzymes are catalysts 1926 尿素酶結晶/蛋白質 Sumner first crystallized an enzyme, urease, and proved it to be a protein 分離ATP Fiske & Subbarow isolated ATP 三、變化路徑的年代(The era of pathway)：生產建築材料及生物能 1933 分離細胞色素C並重建 電子傳遞鏈 Keilin isolated cytochrome C and reconstituted electron transport 1937 檸檬酸代謝循環 Krebs & Johnson postulated the citric acid cycle (TCA cycle) 1948 粒線體是氧化及能量 反應的胞器 Kennedy & Lehniger discovered that the TCA cycle and fatty acid oxidation take place in mitochondria 1951 分離執行脂肪酸氧化 作用的酵素 Green & Ochoa isolated the enzymes of fatty acid oxidation 四、結構的年代(The era of structure)：物性與結構 1934 胃蛋白酶X光繞射圖 Bernal & Crowfoot X-ray photographs of crystalline pepsin. 1950 角蛋白的α-螺旋結構 Paulin & Corey proposed theα-helix structure of keratins 1953 DNA雙螺旋結構 Watson & Crick postulated the DNA double-helical structure 1958 胺基酸序列決定蛋白 質的三維空間結構 Anfinsen & White concluded the 3-dimensional conformation of proteins is specified by their amino acid sequence 1961 異位酶 Jacob, Monod, & Changeux proposed a theory of the function and action of allosteric enzyme 五、預測與工程的年代(The era of prediction and engineering)：掌控生命 1955 基因是突變點 Benzer carried out fine-structure genetic mapping and concluded that a gene has many mutable sites 定義操縱子、信使 RNA Jacob & Monod proposed the operon hypothesis and postulated the function of messenger RNA 1965 遺傳密碼 Nirenberg, Khorana, & Ochoa identified the genetic code words for the amino acid 1970 致癌基因 Martin discovered first oncogene Src 反轉錄酶 Baltimore & Temin discovered reverse transcriptase in retroviruses (RNA-dependent DNA polymerase ) 1985 人類基因體計畫 Human genome project initiated

觀看的年代 • 感官依賴、眼見為憑 • 環境的操控：嚴格的對照組 • 回歸物質主義，以實在物為基礎的最佳說明推論 世間繁花似錦 1665 • 感官依賴、眼見為憑 • 環境的操控：嚴格的對照組 • 回歸物質主義，以實在物為基礎的最佳說明推論 世間繁花似錦 1665 看見細胞 Hooke described plant cells and flea (Micrographia) 1668 腐肉生蛆/對照組 Experiments on the Generation of Insects 1677 看見原生物、細菌 Leeuwenhoek described firstly protists and bacteria living 1838 細胞學說 Schleiden & Schwan enunciated the cell theory 1857 物種起源/演化論 Darwin published the "The origin of species" 1865 遺傳定律 Mendel reported the principles of heredity 1884 科霍病原假說 Koch & Loeffler proposed Koch’s postulate

觀看的年代 花了兩百年所開拓的思想模式 1665 看見細胞 物的新世界/擴充視野 1668 腐肉生蛆/對照組 操控型因果推論的原型版：環境 (空間、時間) 1677 看見原生物、細菌 1838 細胞學說 可分解的生命小單位 1857 物種起源/演化論 可變動的物種 1865 遺傳定律 數量方法學 1884 科霍病原假說 操控型因果推論的進化版：物、環境 (空間、時間)

二十世紀的生物科學史，是分子生物學的發展史 這100年，除了舊典範的知識探索， 還有什麼新增的思考工具？

百年不枯寂！ 拆解生物結構物： 以物理、化學為基礎的分離技術 數學推理：物質、能量生合成守衡的演算法 空間推理：剛性三維空間結構的組裝邏輯 操控型因果推論的完成式：改變物的本質

百年不枯寂！ 拆解生物結構物： 以物理、化學為基礎的分離技術 數學推理：物質、能量生合成守衡的演算法 空間推理：剛性三維空間結構的組裝邏輯 操控型因果推論的完成式：改變物的本質

分離提純的年代：以物理、化學為基礎的分離技術 • 技術信賴 • 論證肉眼不可見的自然現象的範疇 • 生命的新語彙 生命現象的新語言 1864 血紅素蛋白結晶 Hoppe-Seyler first crystallized a protein: hemoglobin 1869 發現DNA Miescher discovered DNA 1893 證明酵素的催化性 Ostwald proved enzymes are catalysts 1926 尿素酶結晶/蛋白質 Sumner first crystallized an enzyme, urease, and proved it to be a protein 分離ATP Fiske & Subbarow isolated ATP

看見獨立物 我(Robert Koch)剛讀到Nägeli的書…我很少看到會有這麼多錯誤與胡說八道的書。針對他要回答的問題，他的實驗並不合格，因為它用的是大雜燴的培養材料。 Note: Heymann B. 1932 Robert Koch. I. Teil. 1843-1882. Akademische Verlagsgesellschaft, Leipizig, p218. (寫給Cohn F(11 Nov. 1877)的信)。Carl von Nägeli (1817-1891)植物學家，不相信Cohn的細菌分類。Nägeli曾建議孟德爾以Hawkweed為材料再驗證一下他的結論。

FEBS Journal 280 (2013) 6456–6497 ª In mammals, the protein makes up about 96% of the red blood cells' dry content (by weight), and around 35% of the total content (including water).     Robert I. Weed, Claude F. Reed, George Berg, (1963). Is hemoglobin an essential structural component of human erythrocyte membranes?  J Clin Invest. 42 (4): 581–88. 

Sumner JB. The chemical nature of enzymes Sumner JB. The chemical nature of enzymes. Nobel Lecture, December 12, 1946. 跟菜市場裡挑選好蔬菜有何不同？ 我們使用的商業刀豆豆粉質量下降，除非我們再酒精濾出液中加入少量乙酸 ，否則得不到尿素酶晶體。即使如此，晶體的產率也低。分析顯示，最近的 刀豆樣品與早期的樣品相比，尿素酶的含量只有一半。因此我們著手想辦法 來獲得人滿意的豆粉，或刀豆。我們在康乃爾溫室內種植刀豆。豆子生長不 佳，產量比種下去的豆子還少。我們也從得克薩斯州，瓜地馬拉和洪都拉斯 買刀豆，但是它們的尿素酶含量低。我碰巧遇到了一位植物生理學家Albert Muller博士，他說他可以替我在波多黎各的Myaguez種一些刀豆。我給他我僅 剩的一公斤富含尿素酶的刀豆。大約七個月後，波多黎各送來一桶豆子。這 些豆子的尿素酶含量很高。磨粉後可得到大量的尿素酶晶體。後來，我們從 阿肯色州農民那裡獲得優質的刀豆，它供應我們豆子至今。

分離提純的年代的挑戰：物性突現 emergence occurs when "the whole is greater than the sum of the parts," meaning the whole has properties its parts do not have.  複雜系統中，子單元之間的交互作用而生成系統中的屬性，無法化約到次級單位分 子間的功能上。這些屬性稱為突現。突現蘊含的概念之一是：生命現象具有不可化 約、不可預測性。 物性突現的另一個概念是功能的階層性。對科學實作而言，階層性的限制是個研究 系統的問題，無法透過邏輯推論來解決。Hoppe-Seyler、Sumner等人研究細胞 組成，單純是以化學家的角度，找尋新的有機物，並沒有急著要解釋複雜的生命現 象的企圖。 過早的提問，效益不大。

百年不枯寂！ 拆解生物結構物： 以物理、化學為基礎的分離技術 數學推理：物質、能量生合成守衡的演算法 空間推理：剛性三維空間結構的組裝邏輯 操控型因果推論的完成式：改變物的本質

變化路徑的年代：物質、能量生合成守衡的演算法 • 數字化的演繹模式 • 標籤追蹤 • 建立以功能干預為基礎的因果關係 生產建築材料及生物能 1933 分離細胞色素C並重 建電子傳遞鏈 Keilin isolated cytochrome C and reconstituted electron transport 1937 檸檬酸代謝循環 Krebs & Johnson postulated the citric acid cycle (TCA cycle) 1948 粒線體是氧化及能 量反應的胞器 Kennedy & Lehniger discovered that the TCA cycle and fatty acid oxidation take place in mitochondria 1951 分離執行脂肪酸氧 化作用的酵素 Green & Ochoa isolated the enzymes of fatty acid oxidation

TCA cycle1953年諾貝爾生理學或醫學獎

檸檬酸代謝循環，TCA cycle Krebs HA & Johnson WA, 1937. The role of citric acid in intermediate metabolism in animal tissues. Enzymologia 4: 148-156。‎ Krebs 及Johnson注意的是：在有肝醣等碳水化合物之下，只要添加少量的 檸檬酸(citric acid)就可以促進大量氧氣消耗，而所消耗的氧氣遠遠大於氧 化檸檬酸所需要的氧氣。 研究設計很簡潔，都是體外試管中的生化反應實驗，只有三類： 在肌肉細胞懸浮液中加入各種代謝有機酸，測量細胞的耗氧量 (A影響B)。 測量呼吸過程中，特定有機酸的總量 (A的動態)。 以代謝抑制物質阻斷特定反應後，測量耗氧量及特定有機酸的生成量(干預)。

檸檬酸代謝循環文章中，｢在該實驗中，檸檬酸所增加的呼吸量是893µl，而完全氧化添加的檸檬酸的估計值則只要302µl 氧氣｣，語詞所呈現的精確度與物理、化學幾乎是一樣的。

未完成的數學推論 如果沒有其他具體的證據，對於懷疑主義者來說，Krebs 的說明方式只是猜測，並沒有真實性。 Szent-Györgyi認為證據不足是最致命的批評。無法直接追蹤中間代謝產 物是Krebs 及Johnson當時無法辯駁批評的主因。在細胞中，檸檬酸循 環部分的生合成反應是可逆的，而且與其他的代謝循環串聯在一起，成 為複雜的網絡 (相互滲漏)。 解套： 標定(放射線、螢光) 生物統計學

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Schrödinger E. 1944，What is life Schrödinger E. 1944，What is life? The Physical Aspect of the Living Cell. Chapter 1: 在一個生命有機體的空間範圍內，在空間上和時間上發生的事件，如何用物理 學和化學來解釋？…雖然當前的物理學和化學還無法解釋這些問題，這決不可 以成為懷疑生命事件能用物理學和化學來解釋的理由。 The large and important and very much discussed question is: How can the events in space and time which take place within the spatial boundary of a living organism be accounted for by physics and chemistry? The preliminary answer which this little book will endeavor to expound and establish can be summarized as follows: The obvious inability of present-day physics and chemistry to account for such events is no reason at all for doubting that they can be accounted for by those sciences.

結構的年代：剛性三維空間結構的組裝邏輯 • 極度的化約主義 • 以歐幾里德空間為演繹的基礎 • 視覺化的推理模型 物性與結構 1934 • 極度的化約主義 • 以歐幾里德空間為演繹的基礎 • 視覺化的推理模型 物性與結構 1934 胃蛋白酶X光繞射圖 Bernal & Crowfoot X-ray photographs of crystalline pepsin. 1950 角蛋白的α-螺旋結構 Paulin & Corey proposed theα-helix structure of keratins 1953 DNA雙螺旋結構 Watson & Crick postulated the DNA double-helical structure 1958 胺基酸序列決定蛋白 質的三維空間結構 Anfinsen & White concluded the 3-dimensional conformation of proteins is specified by their amino acid sequence

(鮑林)得了感冒，躺在床上嫌無聊，拿了一張紙，畫上 幾個原子和它們之間的化學鍵。然後，以我認為相對正 確的角度折疊紙上的鍵結，並且繼續這樣摺，做出一個 螺旋，直到我可以讓上一匝螺旋和下一匝螺旋之間形成 氫鍵。我只花了幾小時就發現了-螺旋。 鮑林雖然看見了-螺旋，卻藏在心裡三年，最後才因為 擔心 Perutz M搶先而勉強發表。1989年鮑林透露讓他 猶豫的原因：他不滿意的是，-角蛋白的繞射圖顯示， 離主要子午軸線的5.15Å位置有強烈的反射訊號。但是 ，由他的模型和Corey所計算出的-螺旋反射訊號卻會 出現在5.4Å處。

說服的力量之一：可測量的剛性三維空間 Max Perutz 的心思： Eisenberg D. 2003, The discovery of the alpha-helix and beta-sheet, the principal structural features of proteins. Proc Natl Acad Sci USA 100:11207-11210. Max Perutz 的心思： 鮑林和Corey的-螺旋就像一個螺旋樓梯，胺基酸殘基形成了台階，每 一階的高度是1.5Å。根據衍射理論，這種規則性重複結構應該會產生距 離為1.5Å、與纖維軸平面垂直的強烈X射線反射訊號…在興奮得快瘋狂 之下，我回到了實驗室，找出我藏在抽屜裡的一根馬鬃毛…然後以與光 束31°角度擺在X射線束中，使1.5Å的重複結構進入反射位置。之後， 我沖洗出曝光片，緊張得心臟都快跳到嘴裡邊。當我打開燈，我看見在 1.5Å的間距有個很強的反射，一如鮑林和Corey的-螺旋所說的那樣。

說服的力量之二：模型是否能解釋分子特性、推測新的生物功能。 Watson JD. & Crick FHC. 1953, Genetical Implications of the structure of Deoxyribonucleic Acid. Nature 171, 964-967. 華生和克里克提議了幾個需要解答的問題 ： 很明顯地有許多事情仍待發現，才可能說清楚基因複製的樣貌。例如： 多核苷酸的前驅物是什麼？什麼東西能讓這對核酸鏈鬆開而分離？蛋白 質的確切作用是什麼？染色體是一對去氧核糖核酸長鏈，或是由核酸與 蛋白質所形成的串珠所組成？

百年不枯寂！ 拆解生物結構物： 以物理、化學為基礎的分離技術 數學推理：物質、能量生合成守衡的演算法 空間推理：剛性三維空間結構的組裝邏輯 操控型因果推論的完成式：改變物的本質

預測與工程的年代：改變物的本質 • 基因編碼：直接干預與設計生物性質 • 機械工程式的生命藍圖 • 知識風險的認知 掌控生命 1955 • 基因編碼：直接干預與設計生物性質 • 機械工程式的生命藍圖 • 知識風險的認知 掌控生命 1955 基因是突變點 Benzer carried out fine-structure genetic mapping and concluded that a gene has many mutable sites 1961 定義操縱子、 信使RNA Jacob & Monod proposed the operon hypothesis and postulated the function of messenger RNA 1965 遺傳密碼 Nirenberg, Khorana, & Ochoa identified the genetic code words for the amino acid 1970 致癌基因 Martin discovered first oncogene Src 反轉錄酶 Baltimore & Temin discovered reverse transcriptase in retroviruses (RNA-dependent DNA polymerase ) 1985 人類基因體計畫 Human genome project initiated

對照組的演化 操控型因果推論的初階版：環境 (空間、時間) 操控型因果推論的進化版：可見物、環境 (空間、時間) 調整原因，得到預期的結果 操控型因果推論的初階版：環境 (空間、時間) 操控型因果推論的進化版：可見物、環境 (空間、時間) 操控型因果推論的完成式：透過基因技術改變物的本質、環境 (空間、時間)

人類基因體計畫年表 1984年，在美國猶他州的Alta，第一次討論了人類基因組測序的價值。Cook-Deegan R. The Alta Summit, December 1984。 1988年，國際人類基因組組織（HUGO）宣告成立。 1989年美國正式成立國家人類基因體研究中心(National center for human genome research)，1990年啟動第一階段的五年計畫。2000年6月26日，宣布人類基因組計劃 工作草圖完成 2003年序列定稿完成。 2004年，國際人類基因組測序聯盟宣布，人類基因組中所含基因的預計數目從先前的 30,000至40,000調整為20,000至25,000。

控制與利用的本質 Dulbecco： . Science, 231:1055-1056. Dulbecco是1975年諾貝爾生物醫學 獎得主，長年專注於癌症的研究，是引領致癌基因研究的旗手。 回顧16篇重要的癌症研究論文，總結當時的研究瓶頸。我們有兩種選擇：其一，繼續以 零碎的研究方式來發現致癌的重要基因；或者，將選定動物模式的基因體定序。 許多研究領域將受益，例如促進神經系統的發展和組織的研究。也有助於遺傳性疾病或 疾病傾向的鑒定和診斷。這些知識將迅速應用於許多領域的治療上。 DeLisi ：American Scientist, 76:488-493. DeLisi在1985-1987年間任職美國 能源部健康與環境研究計畫主任，以政府部門的身分，起草人類基因體計畫案。 ｢人類基因體計畫｣是生物科學研究的第一個「大科學」，它的重點不在研究本身，而是 建立研究醫學所需要的資源。 有助於提升醫療品質、增強經濟競爭力。

人類基因體對科學上的實質影響