多層殼核形式之聚乙烯亞胺複合磷酸鈣奈米顆粒作為 102年度「產業人才扎根計畫」表面處理學程-「實務習作」成果海報 大同大學材料系 多層殼核形式之聚乙烯亞胺複合磷酸鈣奈米顆粒作為 高效率非病毒基因載體之研究 102年度「產業人才扎根計畫」表面處理學程-「實務習作」成果海報 劉俊宏 Chun-Hung Liu 指導教授：吳錫芩 Hsi-Chin Wu*（hcwu@ttu.edu.tw） 實驗介紹與目的 簡介：基因治療是一種嶄新且具有優勢的治療策略。基因載體的設計及材料選擇對轉染效率而言，佔有舉足輕重的地位。相較於病毒載體而言，非病毒載體（non-viral vector, NVV）於臨床上較無使用上之疑慮，但轉染效率低仍是有待克服的問題，因而使得目前研究趨向於開發具有高轉染率之NVV。磷酸鈣（calcium phosphate, CaP）是一種與天然骨頭基質相似的鹽類，已被發展為一種簡易製作且廣泛運用於體外的NVV，聚乙烯亞胺（Polyethyleneimine, PEI）已被開發為NVV之應用，藉由其所攜帶之正電性經由靜電吸引與具負電之pDNA緊密連結，同時亦能與帶負電之細胞膜相互吸引後增加進入細胞內的機率，PEI可經由質子海綿效應(Proton sponge effect)，有效提高目標基因進入細胞核來提高轉染率。 目的：開發PEI複合pDNA之CaP多層殼核形式之奈米顆粒做為NVV，可藉由內吞作用進入人類骨母細胞（ Human osteoblasts cell , HOB）內，經質子海綿效應將目標基因-質體DNA綠色螢光蛋白（plasmid DNA encoding enhanced green fluorescent protein, pEGFP）釋放於細胞質中進入細胞核，形成具有良好生物相容性及高轉染效率之新型NVV應用於骨組織再生修復。 實驗與方法 Material Test A B C Ca(NO3)‧4H2O CaP pDNA DLS FTIR TEM Transfection (NH4)2HPO4 Single CaP Ca2+ PO43- Figure2. 利用穿透式電子顯微鏡(TEM)觀察 （A）CaP ；（B） Tcap；（C）TCaP(PEI)之形態 Triple CaP(PEI) Triple CaP pDNA Double CaP PEI Table1. DLS分析CaP NP之ζ及顆粒尺寸分析 （表面為CaP(c) ；pDNA(p)；PEI (PEI)） Sample (pDNA) CaP(c) － SCaP(p) ＋ DCaP(c) TCaP(p) TCaP(PEI) Size (nm) 3869 299.1 351.1 448.5 140.2 Zeta (mV) -3.4 -34.1 -15.2 -24.3 +23.6 PDI 1 0.66 0.79 0.68 0.30 Figure3. 利用Fluorescence microscope(FM)觀察HOB細胞於 (A1-4)市售轉染劑LTX。(B1-4)單純DNA ；(C1-4)TCaP；(D1-4) TCaP(PEI) 轉染後1天之表現。（刻度尺為100 µm） Table2. 轉染HOB細胞之載體參數、轉染率與細胞活性分析 Sample PEI/ DNA(µg/mL) 轉染率(%) 細胞活性(%) LTX -/ 1 39.40±4.43 47.30±9.82 pEGFP -/ 30 30.26±3.02 65.00±4.04 TCaP -/6.94 50.33±3.84 59.4±2.35 TCaP(PEI) 3.47/ 3.47 59.26±5.21 52.2±2.45 Figure1. FTIR分析(A)TCaP(PEI)、(B)TCaP、 (C)CaP及(D)PEI之吸收峰值，可以發現磷酸根峰值(1030cm-1)隨多層核化後消失，且TCaP(PEI)在1638有胺基表現，顯示PEI表面改質成功。 結論 多層殼核結構之Cap NP可有效提升轉染效率。 以PEI進行表面改質之TCaP(PEI)載體，表面呈正電性 （+23.6 mV）、奈米尺寸大小（140 nm）且分散性佳。 TCaP(PEI)能成功攜帶pEGFP進入HOB表現綠螢光蛋白。 TCaP(PEI)具有良好之生物相容性且轉染效率佳（轉染率為59.3%），具有潛力做為新型NVV於未來基因治療之應用 Acknowledgement The authors thank for the funding support from NSC 102-2221-E-036-002-MY3, NSC 102-2815-C-036-001-E Tatung University B103-T02-018.