B7-H4入核对PI3K/ATK信号通路的作用机制探究 尚泽华 2017141492014 周霆岳 2017141221004
可行性分析及意义 本实验建立在大量实验基础上，采用RT-PCR、Western Blot、免疫荧光定位等的常见实验手段，拟解决B7-H4入核对PI3K/ATK信号通路的作用机制，在一定程度上可为抗肿瘤药物设计上提供新思路
引言 B7-H4属于B7家族，是一种免疫球蛋白超家族。 B7家族负性共刺激分子是近年来发现的非常重要的免疫负性调控蛋白，在免疫调节过程中发挥重要作用，抑制 T 细胞的活化，下调 T 细胞的表达。研究发现，B7家族负性共刺激分子在多种来源的肿瘤组织中高表达，参与肿瘤免疫耐受的调控，使得肿瘤浸润能力及增殖能力加强。所以，B7-H4 与肿瘤的关系是当前研究的热点。
引言 B7-H4 的 DNA 位于 1 号染色体上，是由 5 个内含子和 6 个外显子组成，编码的蛋白质含有 282 个氨基酸，属于Ⅰ型跨膜糖蛋白， 组成蛋白质的结构主要包括胞内区、跨膜区、IgV_x0002_IgC 胞外区及信号肽区。另外 B7-H4 中外显子 6 可选择性剪接而产生两种转录表达产物：一种存在于细胞表面，另一种存在于血清中，二者功能不同 www.islide.cc
引言 现有研究表明，B7-H4在肿瘤细胞内表达高于其它正常细胞，且B7-H4可以存在于肿瘤细胞的细胞质内。 细胞表面的B7-H4 与T细胞表面受体结合，调控T细胞分泌 血清中的B7-H4 抑制T细胞增殖 肿瘤细胞中细胞质的B7-H4 ？
引言 B7-H4 与 PI3K-AKT-mTOR 信号转导通路有着重要联系，因为这个通路和抑制细胞凋亡有关，B7-H4有可能是通过PI3K-AKT-mTOR 通路提升肿瘤细胞增殖和浸润能力 PI3K-AKT-mTOR B7-H4
引言 已有文献证明，当PI3K-AKT-mTOR 信号转导通路被抑制，B7-H4在胞内含量无变化，但在细胞内定位受到影响
引言
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引言 1、肿瘤免疫逆向信号通路 2、PI3K /AKT 信号参与调控B7-H4 亚 细 胞 定 位的具体调节机制仍不清楚。
实验目的 已经有研究表明抑制PI3K/AKT通路会影响B7-H4的亚细胞定位，即当用LY294002阻断PI3K/AKT信号通路后，B7-H4会发生核转移。 我们的工作在于研究B7-H4的核转移的意义是什么？ （肿瘤免疫逆向信号通路） B7-H4是怎么转移到核里面去的？ （亚细胞定位的具体调节机制） www.islide.cc
猜想假设：针对B7-H4发生核转移的意义 根据PI3K/ATK与增殖的关系和B7-H4对癌细胞在免疫逃逸方面的作用，我们猜测B7-H4是作为一种转录因子补偿PI3K/ATK的被抑制效果，即它可以促进细胞表达出PI3K/ATK通路中的被抑制蛋白，从而使得通路回复 PI3K通路被抑制 B7-H4进入细胞核 使被抑制的通路恢复
实验设计 前条件：提已知PI3K/AKT通路受阻的情况下B7-H4会大量发生入核现象 目的：探究B7-H4入核对PI3K/ATK通路的作用 实验手段：体外培养稳定转染B7-H4/HEK293细胞，用GAPDH和α-tubulin为 内参，以正常293HEK细胞中的PI3K/ATK通路中翻译各蛋白质与其mRNA的 量为对照，寻找到各蛋白质的序列，以此来设计引物，用RT-PCR对使用 LY294002阻断PI3K/AKT信号通路，B7-H4发生核转移后的细胞中PI3K/ATK通路 中有关各类蛋白的mRNA进行扩增，通过对细胞中各类关于PI3K/AKT的蛋白，做蛋白质免疫印迹和对扩增后的mRNA检测测出翻译各蛋白质和对应mRNA量的变化量，同时进行免疫荧光成像观察B7-H4在细胞内的分布 对照组：以一个与B7-H4基因同等大小的假基因在体外培养稳定转染HEK293细胞，排除细胞自身对药物的回复作用。
实验验证 1、用LY294002处理实验组和对照组细胞，抑制PI3K通路，在一定时间后裂解细胞用设计好的Akt抗体和标记抗体进行Western Blot 后续实验的预实验：计算信号通路恢复的时间 同时可以免疫荧光看一下B7-H4有没有出核
实验验证 1、设置两组实验组，第一组作为蛋白质提取检测组，第二组作为mRNA提取扩增组。 2、每次对一个平行组的细胞进行LY294002阻断，每隔一定时间对其分别进行蛋白质和mRNA的提取。 3、对蛋白质：用western blot对蛋白质进行分离，用蛋白质免疫印迹法对蛋白质进行检测。 4、对mRNA：混匀之后均分多份，对每一份加入不同的引物进行mRNA的扩增，随后荧光探针杂交孵育之后用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离定量mRNA. 5、每个时段的细胞进行免疫荧光成像 6、对照组实验操作同上。 www.islide.cc
实验结果预测（t=t0 、t1、t2 ...） RTK PI3K PI-4,5-P2 ATK mTOR …… 实验结果 对照组蛋白质的量 实验组蛋白质的量 实验结果 RTKmRNA PI3KmRNA PI-4,5-P2mRNA ATKmRNA mTORmRNA …… 对照组mRNA的量
实验结果预测 www.islide.cc
结果猜想 根据实验数据画出曲线图看出LY294002阻断时间的长短与PI3K/ATK通路中相关蛋白和mRNA的相关关系 猜测一：通过数据比对发现某种蛋白的mRNA随着B7-H4作用时间的增加而增加，并且其相应蛋白表达量也上升。 猜测二：通过数据比对发现所有蛋白的mRNA与B7-H4作用时间没有相关关系，但有某种蛋白的表达量与时间呈相关关系 猜测三：通过数据比对发现所有蛋白的mRNA和蛋白质的表达量与B7-H4作用时间没有相关关系。
结论猜想 猜想一结论：准确的相关关系可以证明B7-H4作为PI3K/ATK通路中某蛋白的转录因子，使其蛋白质的表达量上升。 猜想二结论：B7-H4作为通路中的某蛋白的促翻译因子或作为某种对抑制Pl3k通路的蛋白作磷酸化或去磷酸化调节的蛋白的转录因子。 猜测三结论：B7-H4入核具有其他作用 符合猜测一和猜测二结果之后，得到结论： B7-H4入核对PI3K/ATK通路起上调作用
进一步猜测 找出PI3K/ATK被抑制后B7-H4入核的机制 在已知该现象的情况下，对B7-H7入核的机制尚且不清楚 已知：凡是入核的蛋白质都有NLS序列，细胞内的核糖核蛋白颗粒会（RNP)会与带有NLS序列的蛋白质结合，将后者转运至核内 推测：通过分析PI3K/AKT通路先下调，B7-H4蛋白后被RNP转运入核的机制可以推测： 1、蛋白激酶的磷酸化B7-H4导致NLS序列的失效 2、特异性蛋白结合遮盖B7-H4 NLS序列
实验验证：蛋白激酶的磷酸化导致NLS序列的失效 前提条件：要想证明是由于PI3K/AKT通路中的蛋白激酶使得B7-H4被磷酸化，就要找出是哪种蛋白与其相互作用，幸运的是，我们在前人的工作中找到了B7-H4的作用蛋白：DNA-PKcs DNA-PKcs是DNA依赖的蛋白激酶催化亚基，是一个分子量大约为460KD的蛋白激酶，其属于PI3K相关蛋白激酶家族的成员，是一种被DNA激活的丝氨酸/苏氨酸激酶。
实验验证：蛋白激酶的磷酸化导致NLS序列的失效 推测： 1、可能是DNA-PKcs导致的NLS序列磷酸化发挥作用 2、可能是DNA-PKcs导致的B7-H4的磷酸化使得其蛋白质结构自身发生了变化，将NLS序列遮蔽
实验验证： 对于猜测 NLS序列的7个氨基酸残基为Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val，而DNA-PKcs是丝氨酸（Ser）/苏氨酸（Thr）激酶，因此不会直接作用于NLS序列。 对于猜测 需要设计实验验证： 提取核内的B7-H4，建立一个B7-H4与RNP产生结合的体系： 实验体系一：分别使用被蛋白激酶磷酸化和非磷酸化的B7-H4与RNP孵育，随后使用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳观察其蛋白质结合情况 实验体系二： 建立敲低DNA-PK表达量下的B7-H4/HEK293中B7-H4和RNP结合的情况
实验结果预测与分析 实验体系一：若实验中非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳显色结果的条带中大于RNP与B7-H4的条带（即两个蛋白结合的复合物）在磷酸化和非磷酸化的B7-H4条件下有差异，则证明B7-H4的磷酸化与否会影响B7-H4立体结构的变化，从而影响NLS序列作用的发挥。 实验体系二：若荧光显微镜下观察到磷酸化与非磷酸化的B7-H4和RNP的结合（通过直观的颜色变化）和B7-H4的入核量有差异，则证明B7-H4的磷酸化与否会影响B7-H4立体结构的变化，从而影响NLS序列作用的发挥。
结论 若以上设想成立，则证明B7-H4的立体结构影响NLS序列的暴露受到PI3K家族蛋白的调控。 推测：正常情况下B7-H4在细胞质中是以磷酸化的状态存在，当使用LY294002阻断PI3K/AKT通路时，由于PI3K家族蛋白的下调使得B7-H4的无磷酸化或介导B7-H4的去磷酸化，使得B7-H4暴露出NLS序列，RNP与核定位序列结合使得B7-H4入核并发挥转录因子的作用，回复PI3K/AKT通路的损伤。