实验三 革兰氏染色法 显微镜测定技术
一 、实验目的与要求: 1.学习并掌握革兰氏染色法 2.学习并掌握测量微生物大小的基本方法
二、实验原理： 1.革兰氏染色法： 是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。
G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经复红复染后就成红色。 G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。
2.测微法 微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，由于菌体很小，只能在显微镜下来测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。 由于镜台测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经过物镜和目镜的两次放大成象进入视野，因此从镜台测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小。
目镜测微尺是一块圆形玻片，在玻片中央把5mm长度刻成50等分，或把10 mm长度刻成100等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上(此处正好与物镜放大的中间像重叠)来测量经显微镜放大后的细胞物象。
三、实验仪器及材料 1.仪器：显微镜、测微尺、酒精灯等 2.实验材料： 菌种：葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌 染色剂：草酸铵结晶紫染液、碘液、 番红、乙醇
四、内容与方法 1.革兰氏染色法 1.涂片 2.晾干 3.固定 4.结晶紫染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色1分钟；水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。
5.媒染：碘液，媒染1min；水洗：用水洗去碘液。 6.脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色20—30s至流出液无色，立即水洗。 7.复染：滴加复红复染1min； 8.水洗：用水洗去涂片上的复红染色液。 9.晾干：将染好的涂片用吸水纸吸干。 10.镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。
革兰氏染色流程图 涂片 固定 结晶紫染色 水洗 碘液 媒染 水洗 酒精脱色 水洗 番红染色 水洗 晾干 镜检 1分钟 1分钟 20-30秒
注意事项： 1.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。 2. 菌龄也有影响。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。 3.不要图片太厚，会造成假阴性或假阳性。
2.测微法 1.分别在低倍镜、高倍镜、油镜下用静台测微尺校正目镜测微尺。 测出的格数乘上目镜测微尺每格的校正值，即等于该菌的长和宽。 2.分别测量枯草芽孢杆菌和葡萄球菌的大小。每种菌测定5个。 注意：特别小心不要压坏测微尺。
五、实验结果： 革兰氏阳性杆菌 革兰氏阴性杆菌
G+球菌与G-杆菌
六、思考题 1.你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？ 2.现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌，请你鉴定其革兰氏染色反应， 你怎么运用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为对照菌株进行涂片染色，以证明你的染色结果正确。 3.在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测定同一菌的大小时，其测定结果是否相同？ 为什么？