国家基金申请中的一些 注意事项 高天明 南方医科大学基础医学院神经生物学教研室

同行评议意见表 科学意义或应用前景 学术思想的创新性 项目的研究内容 （内容是否合适、重点是否突出、关键问题是否准确） 总体研究方案（是否合理、是否可行） 项目组的研究能力（工作基础、SCI论文）

申请书需回答的问题 为什么 立项依据 做什么 研究目标、研究内容 怎么做 研究方案、技术路线 能否做 工作基础、工作条件

立项依据 1. 值得做吗？意义 创新 2. 提出科学工作假说 3. 突出自己的工作 4. 主线清楚 通俗易懂 不要写成综述

创新性是课题的灵魂 创新： 原始创新--研究积累，学科交叉 跟踪创新--读国际一流学术刊物，听学术报告 创新要有依据（理论依据、预试验）

核膜BKca通道的发现及其在缺血性脑神经元死亡中的作用

突出自己的工作 引用了本课题组已发表的20篇文献 附了11个预实验图

Aarts M. ,Liu Y. ,Liu L. ,Besshoh S. ,Arundine M. ,Gurd J. W. ,Wang Y Aarts M.,Liu Y.,Liu L.,Besshoh S.,Arundine M.,Gurd J.W.,Wang Y.T.,Tymianski M. (2002) Treatment of ischemic brain damage by perturbing NMDA receptor-PSD-95 protein interactions Science, 298,846-850 Aarts M,Iihara K,Wei WL, Xiong ZG. Arundine M. Cerwinski W, MacDonald JF, Tymianski M. (2003) A key role for TRPM7 channels in anoxic neuronal death. Cell 115:863-877 Anderson JE and Kong J（孔吉明） (2002) Acetylcholine receptors at the neuromuscular junction of regenerated muscle fibers. Muscle and Nerve 25(2):300-1. Bano D Nicotera P (2007) Ca2+ Signals and Neuronal Death in Brain Ischemia Stroke 38:674-684 Bano D, Young KW, Guerin CJ, Lefeuvre R, Rothwell NJ, Naldini L, Rizzuto R, Carafoli E, Nicotera P (2005) Cleavage of the plasma membrane Na+/Ca2+ exchanger in excitotoxicity. Cell. 120(2):275-85 Bossy-Wetzel E, Schwarzenbacher R, Lipton SA (2004) Molecular pathways to neurodegeneration. Nat Med 10:S2–S9. Bredesen DE, Rao RV, Mehlen P (2006) Cell death in the nervous system. Nature 443:796-802. Buss RR, Sun W, Oppenheim RW (2006) Adaptive roles of programmed cell death during nervous system development. Annu Rev Neurosci 29:1–35. Bustamante JO, Michelette ER, Geibel JR, Dean DA, Hanover JA. McDonnell TJ. (2000). Calcium, ATP and nuclear pore channel gating. Pflugers Arch.439, 433-444. Catsicas M.,Pequignot Y.,Clarke P.G. (1992) Rapid onset of neuronal death induced by blockade of either axoplasmic transport or action potentials in afferent fibers during brain development J Neurosci, 12 4642; Chen M, Sun HY, Gao TM(高天明).(2003) Activation of BK channels mediates hippocampal neuronal apoptosis in culture induced by hypoxia/reoxygenation. J Neurochem,,87(Suppl. 1):137. Chen M, Hu P, Sun HY, Wang CF, Li BX, Gao TM(高天明). (2010) Activation of large-conductance Ca2+-activated K+ channels mediates hypoxia- and ischemia-induced hippocampal neuronal death. J. Neurosci Choi DW (2001) Excitotoxcity, apoptosis and ischemic stroke. J. Biochem Mol. Biol. 34:8-14. Choi DW and Rothman SM (1990) The role of glutamate neurotoxicity in hypoxic-ischemic neuronal death. A. Rev. Neurosci.13:171-182. Choi DW (2005) Neurodegeneration: cellular defences destroyed. Nature 433, 696-698 Danial NN,Korsmeyer SJ (2004) Cell death: critical control points. Cell 116:205-219. Deisseroth K, Mermelstein PG, Xia H, Tsien RW (2003). Signaling from synapse to nucleus: the logic behind the mechanisms. Curr.Opin.Neurobiol. 13, 354-365. Dolmetsch RE,Pajvani U,Fife K,Spotts JM,Greenberg ME. (2001) Signaling to the nucleus by an L-type calcium channel-calmodulin complex through the MAP kinase pathway. Science 294:333-339. Gao J, Duan B, Wang DG, Deng XH, Zhang GY, Xu L, Xu TL (2005) Coupling between NMDA receptor and acid-sensing ion channel contributes to ischemic neuronal death. Neuron, 48: 635-646 Gao TM(高天明) and Xu Z.C. (1996) In vivo intracellular demonstration of an ischemia－induced postsynaptic potential from CAl pyramidal neurons in rat hippocampus. Neuroscience 75（3）：665-669 Gao TM(高天明), Pulsinelli WA, Xu ZC. (1998a) Prolonged enhancement and depression of synaptic transmission in CA1 pyramidal neurons induced by transient forebrain ischemia in vivo. Neuroscience,87:371-383. Gao TM(高天明), Howard EM, Xu ZC. (1998b) Transient neurophysiological changes in CA3 neurons

主线清楚 通俗易懂 脑卒中是我国第二大死亡原因及首位致残原因，脑卒中后的继发性神经元死亡是由于脑组织缺血缺氧所致；脑创伤是平时和战时常见的中枢神经致残和致死原因之一, 脑创伤后继发性神经元死亡是造成伤病员致残、致死的主要病理机制，这种继发性神经元死亡也主要是由于损伤脑组织缺血缺氧所致。而目前对缺血性脑损伤的机制仍末阐明，临床也无理想的治疗手段。因此，我们拟以缺血性脑损伤机制为突破口，试图探寻神经元损伤的普遍机制，为脑神经元损伤保护提供新的理论依据。

主线清楚 通俗易懂 缺血性神脑经元死亡 神经元的存活依赖于生理水平的电活动 神经元内在的活动依赖性存活机制异常与缺血性神经元死亡 1、细胞膜钙通道功能抑制及BK通道功能增强参与了缺血性神经元死亡 2、核膜BK通道功能增强与缺血性神经元死亡

主线清楚 通俗易懂 基于上述研究结果，我们提出：核膜BKCa通道在调节核内钙信号及钙敏感基因转录活性中具有重要作用，是将神经元电活动编码为基因转录的钙信号传递过程中的一个关键调控分子。核膜BKCa通道可感受胞浆钙浓度变化，通过调控Ryanodine受体介导的核周隙钙库释放，使核浆钙浓度仅在一定范围内波动。因此，有必要探讨核膜BKCa通道在调控活动依赖性基因转录的钙信号传递过程中的作用及其机制，以及核膜BKCa通道功能异常在缺血性脑损伤中的作用及分子机理，而有关这方面的研究目前尚未见报道。 本研究不但会为以继发性神经细胞损伤为病理特征的脑卒中和脑创伤的分子机理提出新的理论，也可能为Alzheimer’s、Parkinson’s等神经退化性疾病的发病机理提供新的线索，而且为脑卒中及脑创伤的治疗提供新策略和新靶点。活动依赖性基因转录不仅对于神经元存活重要，而且对于突触发育及可塑性、记忆形成以及情感行为等也至关重要，因此，本研究还有助于阐明这些重要脑功能的分子机制。

研究内容、研究目标与 拟解决的关键问题

研究内容：一定写明实验的面的 实验方法 ：按我们以往报道的方法制备 ---- 研究方案：建议用路线图

可行性分析 研究假说合理：本项目所提出的假说是基于我们最近的实验结果，并结合国际相关领域的最新研究进展而产生的，因此项目在理论上是可行的。 前期工作基础良好：申请人及课题组主要成员长期从事离子通道及缺血性脑损伤机制的研究，熟悉该领域的研究动态，发表了多篇高质量科研论文，积累了丰富的科研工作经验，为本项目的开展奠定了坚实的理论和实验基础。 实验技术成熟：本项目所需的各种实验技术，如在体和离体脑缺血模型制作、组织病理、海马神经元培养、膜片钳记录、钙浓度测定、免疫印迹、基因转染、慢病毒感染、RNA干扰、免疫细胞化学、神经元转染等技术，课题组成员均已熟练掌握，并应用这些技术发表了多篇科研论文（详见研究基础）。BKCa通道基因敲除小鼠是从德国Peter Ruth教授实验室获得，已在本校动物中心繁育，正在增加动物数量。本项目所需的各种质粒和抗体均已获得，并已被证实可靠。因此本课题在技术上是可行的。 实验条件完善：本室配置有膜片钳、细胞培养、免疫组化、分子生物学、组织病理、图像分析等技术的全套实验仪器；我校中心实验室配置有激光共聚焦显微镜、电镜、流式细胞仪、超速离心机等研究所需要的大型设备。因此，已具备了完成本课题所需的全部实验设备。 人员结构合理：本课题工作量较大，但本课题组研究人员素质高，拥有长江学者2名，博士学位获得者占全组人员的80%以上，并且每年有3名研究生递增加入课题组，因此可按计划完成本项课题。

本项目的特色与创新之处 以往国际上对离子通道的研究主要集中于对细胞膜离子通道功能的研究，而对于核膜离子通道的功能知之甚少。我们的前期预实验结果首次发现在神经元核膜上表达功能性BKCa通道，并提出“-----” 。而目前尚未见在包括神经元在内的各种类型细胞的核膜上表达BKCa通道的报道。 以往国际上对脑缺血激活的细胞死亡通路进行了大量的研究，并针对一些在介导细胞死亡中发挥重要作用的靶分子研发了神经保护药物，但所有的临床试验均宣告失败。然而，目前对神经元内在的活动依赖性存活机制异常在缺血性神经元死亡中的作用了解甚少。本研究基于我们前期的预实验结果首次提出，“------”。通过本研究，我们将阐明一种新的缺血性神经元死亡机制，这不但会为以缺血神经元死亡为病理特征的脑卒中和脑创伤的发生机理提出新的理论，而且可能为缺血性脑损伤的保护提供新的策略（--激活神经元内在保护机制）和新靶点（--BKCa通道）。 以往国际上对钙信号在缺血性神经元死亡中作用的研究主要集中于对胞浆钙离子功能的研究，本研究则着眼于核内钙信号。通过本研究，对全面了解钙离子在细胞中的生理及病理功能具有重要意义。

研究基础与工作条件 申请者所在的脑损伤及修复实验室是我校教育部重大疾病转绿组与蛋白组学重点实验室的成员之一，依托的神经生物学学科是广东省重点学科。------ 本项目负责人高天明教授长期从事---- 本课题组已开展了大量的前期研究和预实验研究（详见立论依据部分） 本实验室拥有膜片钳室、细胞培养室、免疫组化室、病理组织学实验室、分子生物学实验室、蛋白组学实验室、电生理室、手术室、行为室、图象分析室，实验室面积1300 m2，仪器设备值800余万元。 配备的主要仪器设备包括：--------

申请者简历 申请者和项目组主要成员 学历 研究简历 学术奖励 文章目录 承担的任务

高天明 南方医科大学基础医学院院长，神经生物学教研室主任、教授、博士生导师，长江学者”特聘教授，国家杰出青年基金获得者。 1994年中山医科大学获博士学位。1995-1998年在美国田纳西大学及印第安那大学做博士后。2005-2006年在美国乔治亚医学院分子医学和遗传学研究所Visiting Professor。 现兼任中国神经科学会常务理事及突触可塑性分会主任委员、《Neuroscience Bulletin》等6 家杂志编委、《Stroke》等10 余家杂志的审稿人。2000 年当选“中国人民解放军总后勤部科技新星”，2004 年获总后优秀教师，2007 年获丁颖科技奖和南粤优秀教师，2009年获中国神经科学会赛诺菲-安万特优秀学者（1人/年）。 1987年起从事“中枢神经元离子通道及其基因表达的研究”，发表论文20余篇。于1995年至1998年在美国脑缺血研究领域权威Pulsinelli教授实验室从事脑缺血后海马神经元死亡机制的研究。1998年回国后，在国家杰出青年科学基金、国家自然科学基金重点项目、973子课题等课题资助下，开展了离子通道功能异常在脑缺血后神经元死亡中的作用和机理研究。近年以通讯作者在Neuron, J Neurosci等SCI刊物上发表科研论文20 余篇。以第一作者，获广东省科学技术奖一等奖1项、中华医学奖二等奖1项、教育部自然科学奖二等奖1 项、军队科技进步二等奖1 项。在培养的研究生中，1 名博士生获全国优秀博士学位论文（2008），3 名博士生获全军或广东省优秀博士学位论文（2003，2007，2008）。在本项目中负责实验设计、并承担膜片钳等方面的研究工作。

近年发表的与本项目有关的论著（#通讯作者）： Zhu XH#, Yan HC, Qu HD, Chen L, Li SJ, Cao X, Das M, Qiu XS, Chen LH, Mei L, Gao TM#. (2010) Antidepressant effects of intermittent hypoxia by promoting hippocampal neurogenesis in adult rats. J. Neurosci 30(38):12653-63. (IF: 7.490) Chen M, Sun HY, Li SJ, Das M, Kong JM, Gao TM# (2009) Nitric oxide as an upstream signal of p38 mediates hypoxia/reoxygenation-induced neuronal death. Neurosignals 17: 162–168. (IF: 5.75) Li XM, Yang JM, Hu DH, Hou FQ, Zhao M, Zhu XH, Wang Y, Li JG, Hu P, Chen L, Qin LN, Gao TM#. (2007). Contribution of down-regulation of L-type calcium currents to delayed neuronal death in rat hippocampus after global cerebral ischemia and reperfusion. J. Neurosci 27:5249-5259. (IF: 7.490) Woo RS, Li XM, TaoY, Carpenter-Hyland E, Weber J , Wu J,.Huang YZ, Lai C, Xiong WC, Gao TM#, Mei L# (2007) Neuregulin-1 enhances depolarization-induced GABA release. Neuron 54:599-610. (IF: 13.410) Tjong YW, Jian KH, Li M, Chen M, Gao TM#, Fung ML#.(2007) Elevated endogenous NO increases Ca2+ flux via L-type Ca2+ channels by S-nitrosylation in rat hippocampal neurons during severe hypoxia and in- vitro ischemia. Free Radical Biology& Medicine 42(1):52-63. (IF: 5.44)

王雪敏，南方医科大学基础医学院神经生物学教研室教授，博士生导师。 1998年起从事“中枢神经元死亡的信号转导机制的研究”，包括多种损伤性刺激诱导的小脑颗粒神经元凋亡的分子机制，脑损伤的分子机理及药物对神经元的保护作用。 2001年在中山医科大学获博士学位，2001年至2007年在美国布朗大学和艾默里大学神经生物学实验室从事神经元死亡机制的研究，主要研究转录因子MEF2在神经元存活/死亡中的作用及调控。2007年6月回国后任南方医科大学神经生物学教研室教授、博士生导师，目前主持973计划前期研究专项、国家自然科学基金等课题，开展转录因子在脑损伤后神经元凋亡中的作用和调控机制研究。在本项目中承担分子生物学实验等方面的研究工作。

获得资助的决定因素 创新性是评价项目的核心指标 具备完成项目的基础、队伍和条件 依据充分（文献、预实验结果） 研究内容重点突出 技术路线清晰、可行 申报学科恰当

谢谢