第九单元 免疫增殖性疾病的免疫学检验 1.

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1 第九单元 免疫增殖性疾病的免疫学检验 1

2 概 述 免疫增殖病通常是指以浆细胞、淋巴细胞和巨噬细胞异常增生为特征的疾病，其表现往往有免疫功能异常及免疫球蛋白质和量的变化。
与免疫学检验最为密切的是B淋巴细胞异常增殖或其他导致免疫球蛋白异常的免疫球蛋白病，免疫球蛋白病主要表现为高免疫球蛋白血症。

3 当临床上考虑为多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症或其它浆细胞恶变等免疫球蛋白病时，一般先以血清蛋白区带电泳、免疫球蛋白定量检测或尿本－周蛋白定性作为初筛实验。
如果发现有异常球蛋白区带，继而进行免疫固定电泳、免疫球蛋白亚型定量等检测做进一步定量分析和免疫球蛋白分类鉴定。

4 实验一 血清免疫固定电泳实验

5 实验目的 本实验以血清免疫固定电泳实验为例进行实习
通过实习，熟悉血清免疫固定电泳的实验过程及注意事项；掌握血清免疫固定电泳检测M蛋白的基本原理与临床意义。

6 实验原理 将患者血清在琼脂糖凝胶介质上经电泳分离后，将固定剂和各型Ig及其轻链抗血清加于凝胶表面的各自泳道上，经孵育让固定剂和抗血清在各自泳道对应的凝胶内渗透并扩散，若有对应抗原存在，则在适当位置形成抗原抗体复合物并沉淀下来。电泳凝胶在洗脱液中漂洗，去除未结合蛋白质，仅保留贮存在凝胶内的抗原抗体复合物。经染色后蛋白质电泳参考道和抗原抗体沉淀区带被Acide Violet染色液着色。根据电泳移动距离分离出单克隆组分。

7 试剂与器材 Acide Violet染色液：用1L 10%冰醋酸溶解Acide Violet。
脱色液：用1L蒸馏水溶解Citric Acid Destain。 清洗液：8L蒸馏水溶解Tris-Buffered Saline。 电泳仪：spife 3000全自动电泳仪。

8 Spife 3000全自动电泳仪

9 操作步骤 样本处理： 用生理盐水将血清标本适当稀释后备用，其中同一份血清第一泳道样本稀释3倍，第二至第六泳道样本稀释5倍。

10 区带电泳 上样 胶片准备 电泳

11 沉淀反应 加抗血清 洗涤、烘干 着 色

12 结果分析 对染色烘干后的胶片进行判读。将第一泳道作为血清蛋白分子量参考道，观察第二至第六泳道有无对应的特异性单克隆免疫球蛋白条带。如图12-1所示, 其中sp泳道为血清蛋白参考道，由下至上分别为白蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白、γ球蛋白。第2、3、4、5、6泳道分别为IgG、IgA、IgM、κ、λ抗血清泳道。

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14 注意事项 标本需取新鲜血清进行分析，为避免抗原过剩引起的带现象，血清于加样前应先作适当稀释并混匀。
总免疫球蛋白的水平＞20g/L稀释剂量加倍，当总免疫球蛋白水平＜5g/L稀释剂量减半（除了ELP泳道）。 某些样本（尤其是含有冷球蛋白或冷凝胶）冷藏或冰冻后，可能变得粘稠或混浊。这种样本可能由于扩散障碍而存在点样问题。在这样情况下，加25μl液化剂于75μl血清中，混匀15s。然后按规定程序继续进行。

15 某些单克隆蛋白质可能因多聚体而导致所有的免疫固定泳道上均出现单克隆片段。在这样情况下可加25μl还原剂（1％β-巯基乙醇）于75μl血清混匀并令其反应至少15min（至多3h)后按规定程序继续进行。
在电泳之前，凝胶与电泳槽的贴合面充满电泳介质，并确保两者之间无气泡。

16 在抗血清加入血清加样孔后，确保血清与凝胶之间无气泡。
染色之前的胶片一定要置于洗涤液中充分洗涤，以出去游离的血清和抗血清成分，降低染色后凝胶的背景色。

17 临床应用 本法可对各类Ig及其轻链进行分型，最常用于临床常规M蛋白的分型与鉴定。通常用于单克隆Ig增殖病，单克隆Ig病，本周蛋白和游离轻链病、多组份单克隆Ig病，重链病、脑脊液寡克隆蛋白鉴别、多克隆Ig病的诊断和鉴别诊断。 免疫固定电泳的优点是分辨率高、敏感度高、操作周期短（仅需数小时）、结果易于分析。

18 思考题 结合实验室的免疫固定电泳分析系统，简述血清免疫固定电泳的影响因素及其克服的方法。 温州医学院 陶志华

19 实验二 血清IgG定量检测的可 报告范围评价实验

20 概述 可报告范围指可以报告的所有结果范围，包含两种类型的范围，即分析测量范围和临床可报告范围。
分析测量范围指对没有进行任何预处理（稀释，浓缩等）的标本，分析方法能够直接测定出的待测物范围，也就是系统最终的输出值（活性或浓度）与被分析物的活性或浓度成线性比例的范围，它反映整个系统的输出特性。

21 临床可报告范围 是指对临床诊断、治疗有意义的待测物浓度范围。此范围如果超出了分析测量范围，可将标本通过稀释、浓缩等预处理使待测物浓度处于分析测量范围内，最后结果乘以稀释倍数。

22 实验目的 掌握血清IgG定量检测的可报告范围评价的原理和方法学，了解血清IgG测定方法学的性能。

23 实验原理 由于抗原抗体反应的特殊性，免疫学检测项目应使用多点定标绘制标准曲线，在绘制的标准曲线上查阅结果。由于计算机技术的发展，仪器可对反应响应呈不同表现的结果做适当的处理，直接以最终计量单位方式报告检验结果，在此情况下，评价患者结果可报告范围时，可不必再去评价响应结果的真实曲线状态，只要将样品作不同程度的稀释或配制后，将预期值和实际检测值作比较，绘制在坐标纸上应呈一条通过原点、斜率为1的直线。直线所达的限值即为该方法的患者结果可报告范围。

24 试剂与器材 选用与检测仪器相配套的试剂、校准品及其他辅助试剂 参考选用检测系统中血清IgG的检测范围选择低浓度标本和高浓度标本

25 操作步骤 按标本操作规程做好项目校准、常规质控，保证检测系统处于良好状态。
实验标本的配制，将血清IgG的高（H）和低（L）样品按：5L、4L+1H、3L+2H、2L+3H、1L+4H、5H关系各自配制混合，形成系列评价的实验样品。并计算各样品的预期值。 将系列评价的实验样品上机检测，每标本重复检测2~4次，结果记录于下表。 依照稀释关系，计算各实验样品的预期值。按实验要求，每个样品做6次重复测定，得6个实测值，它们和预期值形成6对数据。

26 结果分析

27 观察结果有无明显的数据差异，若有明显差异时，应判断是否为离群点。
在坐标纸上，以X表示各样品的预期值，以Y表示各样品的实测值，将实验结果点在图上。 若所有实验点在坐标纸上呈明显直线趋势，用直线回归对数据进行统计，得直线回归方程Y=bX+a，若b在0.97～1.03范围内，a接近于0，则可直接判断测定方法可报告范围在实验已涉及浓度。 若b不在0.97～1.03范围内，a较大，试着舍去某组数据，另作回归统计。若缩小分析范围后，回归式有明显改善，若b接近于1，a趋于0。此时，缩小的分析范围可作为真实的可报告范围。

28 注意事项 进行可报告范围实验评价的样品必须与真实标本尽可能相似，也要与真实标本具有相同的基质状态。
评价样品要5个或以上系列浓度的实验样品，浓度范围遍及整个预期可报告范围。最高浓度的样品应达到可报告范围的上限。 若收不到低值样品，可收集高值样品，经系列不同程度稀释，形成系列评价样品。 一天内做完本实验，一般每个实验样品做2～4次重复测定。综合所有结果作统计学处理。

29 应仔细阅读试剂说明书，某些检测项目不适宜用稀释方法获取系列浓度的临床新鲜血清标本，可采用商品质控物、校准品等。
临床可报告范围的评价要对分析标本进行最大稀释度的评价实验，以此作为临床可报告范围的上限；如果低限有临床意义时，可增加分析标本反应量来进行检测下限评价实验，并以此作为临床可报告范围下限。

30 临床应用 可报告范围评价是评价在此范围内不同患者标本报告结果间的比值与各标本内含有的分析物确实存在这样的比例关系。

31 思考题 若血清IgG低值为0.5 g/L（L）、高值为40.0 g/L（H），请计算按：5L、4L+1H、3L+2H、1L+4H、5H关系配制的系列实验样品理论浓度分别为多少？ 温州医学院 陶志华

32 病案讨论 免疫增殖性疾病

33 某患者，男，48岁。主述“乏力，脸色苍白，骨骼疼痛、背痛”六个月，体检发现：皮肤黏膜苍白，局限性骨骼压痛，伴肝脾肿大。辅助检查发现：（1）血象：Hb 8.2 g/dl，WBC血小板 红细胞、白细胞和血小板镜检形态学正常，分类可见幼粒、幼红细胞，红细胞呈缗钱状排列；（2）骨髓象：增生活跃，浆细胞占20％，并发现形态异常的骨髓瘤细胞。其余各系细胞大致正常；（3）骨X线片、CT或同位素扫描：可发现多部位穿凿样溶骨性病变或广泛性骨质疏松。

34 问 题 温州医学院 陶志华 根据以上初步检查结果，该患者初步诊断为什么疾病？
根据你的理论知识，该患者还需做哪些免疫学检验项目？可能结果如何？ 与哪些疾病需进行鉴别诊断？ 温州医学院 陶志华