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第四章病毒感染实验诊断 一般原则是特异敏感、快速和简 便。首先根据流行病学和临床特 点，初步判断可能感染的病毒。
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然后根据可疑病毒的生物学特点、 机体免疫应答和临床过程，以及 病人当前所处的时机，确定实验 诊断方法。
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1.对潜伏期短，发病时尚无抗体产 生，可选择测定病毒颗粒、病毒 抗原或核酸。
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2.对潜伏期超过十天的感染，可 检测特异性的IgM抗体来进行早 期快速诊断，及区别初次和再 次感染。
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3.对可在体内形成持续感染或潜伏 感染的病毒，可检测急性期和恢 复期双份血清的IgG抗体有无4倍 以上升高，或直接检测病毒核酸。
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4.对原因不明或有新病毒感染时， 应采集标本进行病毒分离，同 时应采取双份血清以确认分离 的病毒为病原体。
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5.对同一症状可有多种病毒引起的 情况，应同时检测几种相关病毒 的病毒颗粒、抗原或抗体， 6.对由多个型别组成的病毒可测定 它们的共同抗原。
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第一节标本采集与运送 一、标本的采集 1.采样时间 尽可能在发病的初期， 急性期或患者人院的当天进行。
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2.标本种类的选择 根据临床感染 的症状及流行病学资料，判断可 能感染病毒种类，选择相应部位 采取标本。
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常见分离病毒标本的选择 病毒 咽拭子 粪便 血液 脑脊液 唾液 组织 柯萨奇A和B组 + 心 单纯疱疹病毒 脑膜 腮腺炎病毒 流感病毒
轮状病毒 HAV HIV 精液
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3．常见标本的采集方法 (1)血液：以无菌取抗凝血10ml。 抗凝选用100n／ml肝素钠。 用于分离CMV、HSV，、黄病
毒、EBV、HIV-1及新生儿肠 道病毒。
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(2)脑脊液：以无菌取脑脊液 1～2ml，冰浴立即送检。 在4℃可存放72h。用于分 离柯萨奇病毒、ECHO病毒、 肠道病毒、腮腺炎病毒。
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(3)宫颈或阴道拭子：采取病灶部 位分泌物，或将拭子伸人宫颈 约lcm停留5秒取出，冰浴立即 送检。用于分离 HSV、CMV。
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(4)粪便标本：取2～4ｇ粪便加 10ml运送液立即送检，用于 分离腺病毒、肠道病毒和轮 状病毒。
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(5)含漱液：用无菌生理盐水让 患者含漱。用于分离流感病 毒、副流感病毒、鼻病毒、 RSV等。
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(6)喉拭子：用压舌板避免唾液 污染，用拭子采取咽喉部表 面。用于分离腺病毒、CMV、 肠道病毒、HSV、流感病毒等。
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(7)尿道拭子及尿液标本：尿道拭 子伸人尿道4cm转动3次，以获 得较多的上皮细胞，用于分离 CMV和HSV。 (8)尸检标本：死亡后尽早采集各 种器官，分别使用器械和容器。
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二、标本的运送和保存 病毒抵抗力弱，室温中容易灭活， 用于分离培养的标本要尽快送检， 4℃下数ｈ或-70℃。 冻存液中加入甘油或二甲基亚砜
(DMSO)等作保护。
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病毒传送培养基以Hanks液为基础加 灭活的小牛血清。为抑制细菌生长加 青霉素100U／ml和链霉素100μg／ml， 为了抑制真菌的生长加入2．5μg／ml 二性霉素B或40μg／ml制霉菌素。
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第二节 病毒分离与鉴定 1.组织细胞培养 根据细胞的来源、 特性和传代次数分为： (1)原代细胞培养：将细胞悬液。 加入营养液培养。形成的单
第二节 病毒分离与鉴定 一、病毒的分离方法 1.组织细胞培养 根据细胞的来源、 特性和传代次数分为： (1)原代细胞培养：将细胞悬液。 加入营养液培养。形成的单 层细胞，称之为原代细胞。
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(2)二倍体细胞株：仍保持二倍体 特性。寿命一般为40～50代， 如人胚肺细胞。广泛用于病毒 分离和疫苗制备。
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(3)传代细胞系：来于肿瘤细胞， 染色体特征类似肿瘤细胞。 常用的有人宫颈癌细胞(Hela)、 人喉上皮癌细胞(Hep-2)。
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2．鸡胚接种 鸡胚是用于分离粘 病毒科、疱疹病毒、痘类病毒 的较为理想的材料。
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3．动物接种 动物对病毒的敏感 性是不同的，选择合适动物十 分重要。小鼠、乳鼠、家兔、 豚鼠、猴等常用于分离病毒。
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常用于病毒分离的细胞 细胞种类 可分离的病毒 原代细胞 非洲绿猴肾细胞 人单核细胞 人胚肾、肺细胞 恒河猴猕猴肾细胞
HSV、RSV、VZV、腮腺炎病毒、风疹病毒 HIV、HTLV、HHV-6 腮腺炎病毒、腺病毒 ECHO、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇A、B组、RSV 二倍体细胞株 人胚肺成纤维细胞株 WI-38、MRC—5 CMV、VZV、鼻病毒 传代细胞系 Hela Hep-2 Vero 柯萨奇A、B组、RSV 腺病毒、RSV HSV、RSV、风疹病毒 、轮状病毒、麻疹病毒
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三、病毒的鉴定 必须通过全面了解其特性才能 得到鉴定。 1.根据临床特点，流行病学资 料，标本来源，大致了解病 毒的一些特性，有助于确认
病毒的种类。
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2.动物感染范围及特点 病毒感 染动物的范围、发病的潜伏期。 3.细胞培养特点。 综合上述资料作出鉴定。
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病毒鉴定的方法 变效应(CPE)。细胞肿大，变圆堆积 成葡萄状，细胞溶解出现空斑，细胞 融合形成多核巨细胞，胞浆内或核内
1.细胞培养的结果观察 病毒增殖后导致细胞发生:①细胞病 变效应(CPE)。细胞肿大，变圆堆积 成葡萄状，细胞溶解出现空斑，细胞 融合形成多核巨细胞，胞浆内或核内 出现嗜酸性或嗜碱性包涵体等；
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②不出现细胞病变现象。 ③细胞培养液pH的变化。
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2.中和试验 病毒与特异性抗体进行免疫反应， 使病毒失去感染性，在细胞培养 和活的机体内不出现病变的试验。 常用细胞培养进行中和试验。如
果特异性抗体能中和病毒，使之 失去感染性，不出现细胞病变效 应，则该病毒为特异性抗体的同 型病毒，
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用于病毒的分型诊断最具敏感和 准确性。也可用于检查患者病后 或人工免疫后，机体血清中抗体 增加情况。
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3.空斑或蚀斑形成试验 空斑是指在单层细胞中被病毒感染引 起死亡的细胞区域，周围被活细胞包 围。一般而言，一个空斑是由一个感染 性病毒颗粒感染所引起的。不同的病毒 引起的空斑形态和大小不同。可进行病 毒颗粒的计数、纯化，结合中和试验可 进行病毒的鉴定。
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4.干扰现象 某些病毒间存在着干扰现象， 如某些型别的鼻病毒能干扰 以后进入的副流感病毒的增 殖，从而阻抑后者的红细胞 吸附作用。
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5.红细胞吸附及吸附抑制试验 正粘病毒，副粘病毒感染的宿主 细胞，病毒增殖后产生细胞病变， 但在细胞表面含有病毒某些抗原
成分(血凝素)，能吸附鸡、豚鼠 或猴红细胞。
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可作为初步鉴定。如果在培养瓶 中加入相应的血凝素抗血清后， 不出现红细胞吸附现象，是为红 细胞吸附抑制试验阳性，可作为 病毒鉴定的依据。
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4．血凝试验及血凝抑制试验 动物或禽类的红细胞产生血凝 现象。加入相应的血凝素抗体 可抑制血凝现象的发生，是为 血凝抑制试验。可作为病毒型
某些病毒可与一定种类的哺乳 动物或禽类的红细胞产生血凝 现象。加入相应的血凝素抗体 可抑制血凝现象的发生，是为 血凝抑制试验。可作为病毒型 别确定的依据。
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5．病毒的大小及形态 可用电子显微镜观察病毒的 大小及形态。
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6．核酸类型鉴别及序列测定 利用5—溴-2-脱氧尿苷(BUDR)抑 制DNA复制的特性，在细胞培养液中 加入该物质，可抑制DNA病毒的复制
和增殖，抑制细胞病变的出现，但对 RNA病毒无抑制作用，以此判断病毒 核酸类型。
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对病毒核酸特异序列或全序列的 碱基排列测定或 DNA杂交、DNA- RNA杂交来鉴定病毒。
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7．耐酸试验 肠道病毒对酸有耐受力，而 鼻病毒在酸性环境下易被灭活。
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8．乙醚敏感试验 被乙醚破坏，而失去感染性，不 能感染细胞。可作为病毒是否具 有类脂包膜的依据，也可用氯仿 或去胆酸钠代替乙醚进行试验。
病毒外围如有类脂包膜，则易 被乙醚破坏，而失去感染性，不 能感染细胞。可作为病毒是否具 有类脂包膜的依据，也可用氯仿 或去胆酸钠代替乙醚进行试验。
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9．免疫荧光抗体染色 将感染细胞固定，用特异抗血 清荧光标记染色，在荧光显微镜 下，可见细胞内荧光，即可确定 型别。
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第三节病毒感染快速诊断 通过测定病毒的特异标志成分，如 特殊形态、特异的抗原成分及病毒 的核酸，早期确认病毒的感染，是
病毒学诊断的重大发展。
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一、形态学检查 1．光学显微镜 观察病毒感染细胞出现的包涵体。 根据特点可作出辅助诊断。狂犬病 病毒在脑细胞出现嗜酸性的圆形或
椭圆形包涵体，称为内基小体。巨 细胞病毒在上皮细胞的细胞核内出 现周围绕有一轮晕似“猫头鹰眼”样 大型嗜酸性包涵体。
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2．电子显微镜检查 (1)电镜直接检查：早期病毒感染标 本的病毒颗粒。如“秋季泻”患儿 粪便中的轮状病毒、甲肝患者粪 便中的HAV，疱疹病毒的疱疹液， HBV患者血清，均可观察到特征性 病毒颗粒。
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(2)免疫电镜检查：在标本中加入 抗体。使病毒聚集成块负染观 察，更易发现病毒体，灵敏度 可提高100倍。
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二、病毒抗原检测 病毒抗原是病毒特异性的标志， 通过免疫学技术检测标本中特 异性抗原存在，可以早期诊断 病毒感染。
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1．免疫荧光技术 适合于型别少， 细胞培养难以成功的病毒，如流 感病毒、副流感病毒、疱疹病毒、 巨细胞病毒、腺病毒等。肝活检 组织中的肝炎病毒、神经组织中 的单纯疱疹病毒、脑组织中的狂 犬病毒或其他脱落细胞和活检组 织中的病毒抗原检测。
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2．酶免疫技术 有酶免疫组化和 酶免疫吸附(ELlSA)试验法。测 定标本中游离的抗原或抗体。 如检测乙型肝炎病毒的表面抗 原(HBsAg)，HIV感染病人的P24 抗体等。
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3.其他技术 如固相放射免疫技术、 发光免疫分析技术、胶体金标记 的免疫层析技术等。
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三、早期抗体检测 检测病毒感染机体后产生的早期特异性抗体，如测定特异性IgM可以快速明确诊断各种病毒引起的新生儿先天性感染，测定HAV感染后抗HAV的IgM抗体可以明确诊断HA等。
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四、病毒核酸检测 只要有完整的特异基因片段存在， 就可进行诊断。
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1．斑点杂交法 将待测的DNA或RNA直接点在杂交滤膜上，变性后，用标记的核酸探针进行杂交。用32p或131I同位素标记的探针通过放射白显影，可直接观察。现用地高辛、生物素等非同位素物质标记，然后采用酶反应或酶免疫技术进行检测，已被越来越多的实验室广泛使用。
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2．固相杂交技术 将核酸探针包被聚苯乙烯微孔 板中，加人待测的核酸序列和 标记的指示探针杂交液中进行 杂交，洗涤后，用酶免疫技术 进行检测。
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3.原位分子杂交技术 在细胞原位暴露DNA或RNA，加入标 记特异核酸探针进行杂交。通过显 色技术可显示特定杂交探针在细胞
内的位置和核酸的数量。
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4.Southern印迹和Northern印迹法
Southern印迹法用于DNA的杂交。提取 DNA,用内切酶切割后，进行琼脂糖电泳 按分子量使DNA分开，将DNA移至硝酸纤 维膜上，用标记探针进行杂交。可以检 测病毒DNA特异序列。 Northern印迹法用于RNA杂交分析。将 琼脂糖电泳后的RNA移至DBM膜上，用标 记探针进行杂交。用于检测RNA或mRNA。
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5．聚合酶链反应(PCR) 选择病毒的特异保守片段作为靶基因，进行引物设计和扩增可诊断病毒性感染。选择病毒的易变区，结合RFLP，测序等技术可以对病毒进行分型和突变的研究。
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(1)DNA病毒：可直接进行PCR扩增 其特异片段。 (2)RNA病毒：可通过RT-PCR技术， 将RNA逆转录为cDNA，再进行 PCR扩增。
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(3)定量PCR技术：对扩增的产物进 行原始标本定量，对病毒感染的 诊断起到了量化的作用。同时， 对研究病毒和机体之间的关系提 供了参考。
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6．病毒核酸的直接检测 有些病毒如轮状病毒的核酸具有典 型的分节段特点。可以从标本中直 接提取轮状病毒的核酸。通过聚丙
烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，观察其特 有的11个核酸节段的条带排列情况， 进行诊断。
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五、病毒检验的结果评价 通过实验手段，从标本中获得有 关病毒感染的证据，从而确定病毒 感染和临床疾病之间的因果关系， 是病毒实验诊断的目标。
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通过分离和鉴定获得致病性病毒， 发现病毒感染的特异征象，如机 体内产生特异性抗体,急性期和恢 复期血清中相应的特异性抗体有4 倍以上的升高，细胞内包涵体的形 成等,就可得出病原学诊断。
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感染病毒的临床意义必须结合流 行病学资料、临床表现、病毒种 类及机体的病理变化作综合分析， 才能判定。
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