8 、天平 balance/scale  称取大量元素 macro-element 、  微量元素 micro-element 、  酶 enzyme 制剂等

9 、培养箱 growth incubator  培养材料

三、玻璃器皿及用具 glassware

1 、玻璃器皿 培养用 显微镜下观察用 细胞微室 载玻片 glass slide 培养皿 petri dish 试管 test tube 三角瓶 conical flask 培养皿等 petri dish

2 、微孔过滤器 filter sterilizer  灭菌用：激素 3 、细胞计数器 / 血球计数板 Hemocytometer  统计培养细胞的数目

4 、接种用具 镊子、剪刀、解剖刀、接种针、接种铲 Forceps\scissor\scalpel \Inoculation needle\shovel

四、培养条件 光照、温度、湿度、气体成分

1 、光照条件 光照强度 intensity 时间长短 period 光照质量 quality  有的材料培养需要光，有的则不需 光  不同植物种所需光照强度不同， Lux /12-16h/ 天  光照会分解生长素

2 、温度条件 3 、湿度条件 o C/25 optimal 4 、气体

 培养基的种类  培养基的成分  培养基的配制 五、培养基及制备

1 、培养基的种类 按性质分 基本培养基 完全培养基 MS 、 MT 、 White 等 基本培养基 + 其它成分 Murashige and Tucker Murashige and Skoog 激素、有机物质等

按状态分 固体培养基 液体培养基  培养材料与培养基接触不充分  有毒物质容易积累  污染局部  通气好  培养材料与培养基接触充分  有毒物质不容易积累  污染全部  通气不好

Solid medium

Liquid medium

2 、培养基的成分  无机盐 inorganic salts  激素 PGR  有机物质 organic  琼脂 agar  碳源 carbon 大量元素 macro 微量元素 micro

2-1 、大量元素 N 、 P 、 S 、 K 、 Ca 、 Mg N ：各种氨基酸 amino acid 、维生素 vit 、 蛋白质 protein 和核酸 NA 的重要成 分 Ca ：细胞壁稳定 cell wall Mg ：酶及辅酶的成分 enzyme/co- enzyme

Fe 、 Mn 、 B 、 Zn 、 Cu 、 Mo 2-2 、微量元素 用量少，过多容易导致中毒

2-3 、激素  细胞分裂素 cytokinin  赤霉素 gibberelin  生长素 auxin 促进细胞分裂和分化不定芽，抑制根的 生长， 6-BA 、 KT 、 ZA 、 2iP 诱导细胞的分裂和根的分化 IBA 、 IAA 、 NAA 、 2,4-D IBA 、 IAA 和 IAA 诱导生根， 2,4-D 诱导愈伤组织 对细胞分裂与分化，以及细胞的增大 有促进 抑制愈伤组织形成，促进芽的形成，

生长素和细胞分裂素的比例决定着发育的 细胞类型，愈伤组织再分化是长根或长芽。 – 生长素 / 细胞分裂素：低促进芽形成 – 生长素 / 细胞分裂素：高促进根形成

adventitious root induction by auxin The most used are IBA, NAA and IAA

BA (benzyl adenine) is widely used in the multiplication phase since promote shoot formation in several species and genotypes and is cheaper than other natural cytokinins BA (or BAP) is a derivate of adenine but it is synthetic

几种激素的配制方法 生长素 细胞分裂素 赤霉素 95% 的酒精或 0.1mol/L 的 NaOH 或 KOH 0.5 或 1mol/L 的 HCl+ 微热 溶于水， pH5.7 但不稳定，用 95% 的酒精 IAA 母液（ stock solution ）每周制备新鲜备用，容易见光分解（几天内）， 也容易被植株组织在几小时到几天内分解。生长素  C 稳定保存 1 小时， 但 IAA 可以被低 pH 、光、氧和过氧化物破坏。 NAA 和 2,4-D 比 IAA 稳定。 CTK 母液可以在冰箱中保存几个月，在长时间的实验中，也可能被分解。 KT 和 ZT 在 120  C 处理 1 小时仍能稳定存在， BA100  C 时 20 分钟。 在碱性条件下， GA 变成无活性的异构体，在强酸性环境和高温下， GA 也变 成无活性的形式。 GA 热不稳定， 114  C 处理 20 分钟降低其活性达 90% ，母 液需制备新鲜的，并且采用过滤灭菌。

2-4 、有机物质 (Vitamins and amino acids) Vit B 1 Vit B 6 Vit B 3 Vit B 5 肌醇 CH LH ME YE 硫胺素 盐酸吡哆醇 烟酸 泛酸钙 水解酪蛋白 (casein hydrolysate) 水解乳蛋白 ( lactoalbumin hydrolysate ) 麦芽提取物 (malt extract) 酵母浸出物 (yeast extract) 促进细胞对培养基的反应

Function of vitamin 维生素 C ：可防止组织变褐； 维生素 B1 ：与愈伤组织的产生和生活力 有 密切关系； 维生素 B6 ：对根的生长有促进； 烟酸：对植物代谢和胚的发育有作用。

2-5 、固化剂（ gelling agent ）  琼脂  来于 seaweed 对植物组织有一定的生理作用  用量一般为 7-10g/L ，即 0.7-1% （ W/V ） 太大，培养基过硬； 太小，培养基不易凝固  不同品牌的琼脂对外植体的反应也不一样。  其它 gelling agent ：  Gelrite （脱乙酰吉兰糖胶）： 透明， Pseudomanas 种发酵产物（多糖） 成分稳定。

Stationery supports When stationery supports are needed gelling agent can be used. But please bear in mind that gelling agent is not the only measure that works for stationery purpose. Others are filter paper, cotton, cheesecloth, vermiculite and special membrane rafts within a liquid medium

滤纸桥

2-6 、碳源  营养物质  渗透压稳定剂 osmoticum stabilizer 类型 蔗糖、葡萄糖 glucose 、果糖 fructose 、山梨醇 sorbitol 、麦芽糖 maltose 、淀粉 starch 等 浓度 2-5% （ W/V ）  低浓度适合于原生质体培养  高浓度适合于胚和花药培养 作用 蔗糖长时间高温处理会发生焦糖化， 形成 蛋白黑素，抑制细胞生长

其 它

2-7 、抗生物质 antibiotics 防止内生菌，可加抗生物质。 Hypocotyls of papaya were contaminated by endogenous bacterium

褐 化 browning

pH 计 3 、培养基的 pH -pH 值： 5.5~6  <5.5 ： the agar will not gel properly  >6 ： the gel may be too firm  灭菌后 pH 会降低  培养材料降低 pH ：产生有机酸， N 利用 - 测定方法  pH 试纸  pH 计 -pH 调整方法  1N 的 HCl 和 NaOH  在加入 agar 前调 pH

4 、培养基的选择、配制和保存 （ 1 ）选择  择材料和种类而异  参考前人的研究 MS 培养基最为基本：  高浓度的 N 、 K 和 NH 4 +  自己试验 （ 2 ）配制程序 配母液（ Stock solution) 取样 加成分测 pH ok

1. 为减少工作量，一般配制所需浓度高 倍的母液； 2 ．配制母液，按所使用药品的类别，分别配成大量元素、 微量元素、维生素等； 3 ．保存：无机成分在一起时，可能产生沉淀，应分别保存； 4 ．要用重蒸馏水，等级较高的化学纯或分析纯的药品，称 量或定容要准确； 5 ．配好的母液瓶上注明母液号、配制倍数、日期、及配 1 升 培养基时应取的量。 6 ．低温下可保存几个月。 （ 3 ）母液配制和保存

 大量无素  微量无素  浓缩 10 倍（量加大 10 倍）  在配制 1L 培养培养基时，只取 ? ml  浓缩 100 倍（量加大 100 倍）  在配制 1L 培养培养基时，只取 ml 母液 stock 的配制

以 KNO 3 为例 1L 培养基需要量为 19g 。 在配制母液时，增加 10 倍量，为 190g 。 在母液中的浓度为 g/L ，即 g/ml 在配制培养基时，取 ml ， ml× g/ml= g

以 KNO 3 为例 1L 培养基需要量为 19g 。 在配制母液时，增加 10 倍量，为 190g 。 在母液中的浓度为 190g/L ，即 0.19g/ml 在配制培养基时，取 100ml ， 100ml× 0.19 g/ml=19g

（ 4 ）培养基分注 1 ．灭菌前分 2 、灭菌后分，三种方法：虹吸式、滴管方法、 漏斗； 3 ．分注适量，一般占试管或三角瓶的 1/3 ～ 1/4 ； 4 ．不要把培养基粘到管壁；分注后马上用棉 盖塞住，并做好标记。

5 、无菌技术  培养基灭菌  器皿试材和接种工具的灭菌  培养室和接种室的灭菌

真菌污染长孢子 污染的情况 细菌污染长菌 落

(1) 、无菌室 培养室和接种室 室内灭菌可用 2% 新洁尔敏擦洗 75% 乙醇喷雾 UV 照射 20 分钟

2 、培养基 灭菌方法有  高温高压蒸气灭菌  过滤灭菌 121°C ， 1.1kg/cm 2,15-20 分钟，时间 过长，培养基成分易变性失效 在高温高压下易分解的培养基和激素类

3 、器皿和接种工具的灭菌 解剖刀、镊子、剪刀等工具采用干 热灭菌法，用烘箱灭菌， 120 °C 时 1 小时

4 、外植体的灭菌  充分灭菌，但不能损伤外植体  不同外植体，灭菌要求不一样 原则

常用方法  75% 乙醇  氯化汞（升汞）  次氯酸钠 表面杀菌，具湿润和杀菌作用，浸 30 秒 常用浓度 0.1% 处理 5-10 分钟，有残毒 浓度 2-10% ，时间 分钟，对植物无害