动物性食品微生物检验 β型溶血性链球菌检验 主讲人：王福红

知识目标： 能力目标： 理解溶血性链球菌的生物学特性。 了解溶血性链球菌的致病性。 掌握β型溶血性链球菌标准检验方法。 会制备β型溶血性链球菌检验用培养基。 会对β型溶血性链球菌进行检验。

溶血性链球菌 链球菌系指一大类呈链状排列的球菌，本菌广泛分布于自然界，存在于水、乳、粪便以及人和动物的病灶内。健康的人和动物的皮肤和粘膜上，呼吸道和消化道内往往带菌。引起各种化脓性炎症，猩红热，丹毒，新生儿败血症，脑膜炎，产褥热以及链球菌变态反应性疾病等。

根据链球菌在血液培养基上生长繁殖后是否溶血及其溶血性质分为三类 甲型溶血（α-溶血）：菌落周围有1-2mm宽的草绿色溶血环，也称甲型溶血，这类链球菌多为条件致病菌。 乙型溶血（β-溶血）：菌落周围形成一个2-4mm宽、界限分明、完全透明的无色溶血环，也称乙型溶血，因而这类菌亦称为溶血性链球菌，该菌的致病力强，常引起人类和动物的多种疾病。 丙型溶血（γ-溶血）：不产生溶血素，菌落周围无溶血环，也称为丙型或不溶血性链球菌，该菌无致病性，常存在于乳类和粪便中，偶尔也引起感染。

按兰氏分类，链球菌可分为从A至V共20个血清群（其中缺I、J群）。每个群结合生化和培养特性又分为若干血清型或亚型。按菌体荚膜抗原不同，分为35个血清型。引起猪病并偶尔经伤口感染人的链球菌主要有：D群的猪链球菌II型，F群的咽峡炎链球菌，L、R、S、T、U、V群链球菌等。

1998年，我国江苏南通地区发生的猪链球菌疫情，病人在发病前2日内均与病、死猪或来源不明猪肉有直接接触史， 19人有屠宰病、死猪的历史(占76.0％)；有3人有销售猪肉史(占12.0％)；另有3人有 洗、切死猪肉或剥猪头皮史(占12.0％)。25人中有7例有明显的手指皮肤破损史，有20例病家周围有病、死猪的发生史。提示人类感染发病与病猪接触密切相关。由于人们对猪链球菌认识还不够，且该菌的形态和生化特征易发生改变，给该菌的分离鉴定带来很大的困难。据此，国外一些学者认为该菌实际感染率比人们报道的要高得多。

四川人-猪链球菌病疫情 2005年6月24日　四川资阳市一户人家养的猪突然死了一头，这家人觉得一头猪值几百块钱，扔掉可惜，于是把死猪肉吃掉。随后，该户人家就有人出现高烧、乏力、恶心、呕吐等症状，被送到资阳市第三人民医院，成为第一例病人。 6月12日、7月15日　第二例、第三例病人出现。7月15日，院方向资阳市疾控中心报告。 7月18日　资阳市疾控中心向资阳市政府报告，发现不明原因疾病。资阳市在当天启动了“突发公共卫生事件应急预案”，资阳市第一人民医院传染科开辟出一个隔离病区，专门收治此类病人。

7月24日　四川正式公布病情，截至中午12时，已统计出累计发病80例，疑似13例，死亡19例，治愈出院4例。住院病例中，病危17例，病情趋于好转40例。 7月25日　国家卫生部和农业部联合发布新闻公告向外界公布调查结果。公告称，四川不明原因疾病病因初步查明，是由猪链球菌引起的人——猪链球菌感染。

7月26日，四川累计报告人感染猪链球菌病病例117例，其中实验室确诊5例，临床诊断71例，疑似41例。这些病例中，治愈出院5例，病危21例，死亡24例。 据四川省卫生厅报告，截至8月3日12时，四川省累计报告人感染猪链球菌病病例206例，其中实验室确诊43例，临床诊断122例，疑似41例。这些病例中，治愈出院26例，病危18例，死亡38例。

7月23日，四川省资阳市雁江区南津镇，面对亲人，不知病因的故去，家属感到悲痛万分。

医生“全副武装”地走进传染病病房

7月23日，四川省资阳市第一人民医院，患者躺在该院的传染病隔离病房内接受治疗。

一、生物学特性 形态与染色特性：革兰氏阳性，无芽孢、无鞭毛、多数无荚膜。直径为0.5～1um，常排列成链状，链的长短不一，短者由4～5个菌体组成，长者可达20～30个甚至上百个。链的长短与细菌种类及生长环境有关。致病性链球菌一般较长，非致病性或毒力弱的菌株菌链较短，在液体培养基中易呈长链，在固体培养基上常呈短链。

猪肝脏链球菌

猪链球菌革兰氏染色

培养特性： 本菌为需氧或兼性厌氧，多数菌株的生长温度为20℃～42℃，最适温度为37℃。 D群的大多数菌株，低至10℃、高达45℃仍能生长。 N群菌株最适生长温度为30℃。 本菌最适pH 为7.4～7.6。

培养特性： 多数致病菌株的营养要求较高，在普通培养基上生长不良，必须加血液、血清、腹水等，如培养基中加入0.5%葡萄糖则有助于细菌生长。 在含鲜血或血清的培养基上生长较好，菌落细小，透明。对猪致病的各群菌均表现为β溶血（个别为α溶血）。

甲型（α）溶血性链球菌 灰色、针尖状菌落、周围有草绿色溶血环（ α溶血）。

乙型（β）溶血性链球菌 菌落特征：灰白色、细小菌落、周围有宽大透明溶血环（ β溶血 ）。

丙型（γ）链球菌 形成灰白色、半透明或不透明，表面光滑，有乳光，直径约0.5～0.75mm的细小菌落，无溶血环。

血平板菌落特征 甲链 乙链 丙链

猪链球菌在羊血平板上的菌落形态

生化特性 ： 对常用的糖类，发酵后产酸产气。 乳糖、甘露醇、水杨苷、蔷薇醇的发酵能力因菌株不同而异。 链球菌一般不分解菊糖（某些草绿色菌株例外），不被胆汁或10%胆盐所溶解，这两点可用来鉴别链球菌和肺炎双球菌。 多数A群链球菌能产生淀粉酶，不仅分解淀粉，也可水解肝糖和淀粉粘胶质。 肠链球菌可在6.5%氯化钠葡萄糖肉汤、40%胆汁肉汤、pH9.6葡萄糖肉汤和0.1%美兰牛乳培养基中生长，能在10℃和45℃下生长，这几点可作为肠链球菌和其他链球菌的鉴别试验。

抗原特性：链球菌的抗原构造比较复杂。β型溶血性链球菌的抗原构造可分为三种： 核蛋白抗原（P抗原）：此种抗原无种、属、型的特异性、各种链球菌的核蛋白的抗原性都是一致的，和肺炎球菌、葡萄球菌的核蛋白有互相交叉反应。 群特异性抗原（C抗原）：细胞壁的多糖成分，有特异性。根据群多糖抗原的不同，可将链球菌分成19个血清群。 型特异性抗原（表面抗原）：链球菌细胞壁的蛋白质抗原，位于C抗原的外层。其中又分M、T、R、S等四种不同的抗原成分，与致病性有关的是M抗原。M抗原主要见于A群链球菌，根据M抗原的不同，可用血清学反应将A群链球菌分为60多个型。

抵抗力：链球菌抵抗力不强。 60℃30分钟即可死亡。 本菌在渗出液及动物排泄物中可生活数周。 D群链球菌抵抗力很强，加热60℃ 30分钟不死。

二、致病性 致病性链球菌常可产生多种酶和外毒素。 透明质酸酶：又称扩散因子。可溶解组织间隙的粘合质——透明质酸，增加组织间隙的通透性，便于细菌和毒素向组织扩散，因此，能增加细菌的侵袭力。透明质酸具有抗原性，可刺激机体产生抗体，不同菌群产生的酶，抗原性不同。 链激酶：又称溶纤维蛋白酶。能使血液中的血浆蛋白酶原变成血浆蛋白酶，即可溶解血块或阻止血浆凝固，有利于细菌在组织中扩散。耐热，加热100℃50分钟仍可保存活性。A群链球菌可产生两种免疫原性不同的链激酶。

铁道酶：又称脱氧核糖核酸酶，主要为A、C、G群链球菌所产生，有A、B、C、D四个血清型。由于此酶能分解粘稠脓液中具有高度粘性的DNA，所以有人提出用含有链激酶和链道酶的制剂来溶解脓疱的脓性渗出物，以利药物治疗。此酶具有抗原性，受链球菌感染可产生抗体，如果这种酶抗体增高，即表示有链球菌感染。 溶血毒素：由溶血性链球菌产生，有溶解红细胞、杀害白细胞及毒害心脏的作用。本菌的溶血毒素主要分为“O”和“S”两种。

红疹毒素：主要是A群链球菌产生的一种外毒素。B、C群链球菌偶尔也产生。红疹毒素除对皮肤的毒性作用外，还有其它多种毒性作用，如内毒素样致热作用，对细胞或组织的损害作用，淋巴母细胞转化作用，免疫抑制作用，提高动物对内毒素发生致死性休克的敏感性等。

溶血性链球菌在自然界中分布较广，存在于水、空气、尘埃、粪便及健康人和动物的口腔、鼻腔、咽喉中，可通过直接接触、空气飞沫传播或通过皮肤、粘膜伤口感染，被污染的食品如奶、肉、蛋及其制品也会对人类进行感染。上呼吸道感染患者、人畜化脓性感染部位常成为食品污染的污染源。一般来说，溶血性链球菌常通过以下途径污染食品： 食品加工或销售人员口腔、鼻腔、手、面部有化脓性炎症时造成食品的污染。 食品在加工前就已带菌、奶牛患化脓性乳腺炎或畜禽局部化脓时，其奶和肉尸某些部位污染。 熟食制品因包装不善而使食品受到污染。 溶血性链球菌常可引起皮肤、皮下组织的化脓性炎症、呼吸道感染、流行性咽炎的爆发性流行以及新生儿败血症、细菌性心内膜炎、猩红热和风湿热、肾小球肾炎等变态反应。

人的临床表现 病例潜伏期短，平均为2～3天，数小时至7天 起病急，畏寒、发热，伴有头痛、头昏、全身不适、乏力等症状 消化道症状有食欲下降，恶心，呕吐，少数患者出现腹痛、腹泻 病例皮肤有出血点、瘀点瘀斑 重症病例进行性休克表现：血压下降，脉压差缩小 部分为脑膜炎：昏迷，脑膜刺激征阳性，脑脊液呈化脓性改变，重者可出现昏迷 重要脏器损害表现为凝血功能障碍、间质性肺水肿、肝脏损害和肾脏损害。

三、检验 食品中β型溶血性链球菌的检验应按《食品安全国家标准 食品微生物学检验》β型溶血性链球菌的检验方法 GB4789.11-2014 进行。

检验程序 鉴定 结果与报告 样品处理 增菌培养 分离培养

1．样品处理及增菌 按无菌操作称取检样25 g（mL），加入盛有225 mL mTSB的均质袋中，用拍击式均质器均质1 min～2 min；或加入盛有225 mL mTSB的均质杯中，以8000 r/min～10000 r/min均质1 min～2 min。若样品为液态，振荡均匀即可。36 ℃±1 ℃培养18h～24h。

2．分离培养 将增菌液划线接种于哥伦比亚CNA血琼脂平板，36 ℃±1 ℃厌氧培养18 h～24 h，观察菌落形态。溶血性链球菌在哥伦比亚CNA血琼脂平板上的典型菌落形态为直径约2mm～3mm，灰白色、半透明、光滑、表面突起、圆形、边缘整齐，并产生β型溶血。

3．鉴定-分纯培养 挑取5个（如小于5个则全选）可疑菌落分别接种哥伦比亚血琼脂平板和TSB增菌液，36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。

3．鉴定-革兰氏染色镜检 挑取可疑菌落染色镜检。β型溶血性链球菌为革兰氏染色阳性，球形或卵圆形，常排列成短链状。

3．鉴定-触酶试验 挑取可疑菌落于洁净的载玻片上，滴加适量3%过氧化氢溶液，立即产生气泡者为阳性。β型溶血性链球菌触酶为阴性。

原理：致病性乙型溶血性链球菌能产生链激酶，使血液中的血浆蛋白酶原变成成血浆蛋白酶，溶解纤维蛋白。 试验方法： 3．鉴定-链激酶试验 原理：致病性乙型溶血性链球菌能产生链激酶，使血液中的血浆蛋白酶原变成成血浆蛋白酶，溶解纤维蛋白。 试验方法： 吸取草酸钾人血浆0.2mL，加0.8mL灭菌生理盐水，混匀。 再加灭菌生理盐水中混匀，再加入经36℃±1℃培养18h～24h的可疑菌的TSB培养液0.5mL及0.25%氯化钙溶液0.25mL，振荡摇匀，置于36℃±1℃水浴中10min，血浆混合物自行凝固（凝固程度至试管倒置，内容物不流动）。继续36℃±1℃培养24h，凝固块重新完全溶解为阳性，不溶解为阴性，β型溶血性链球菌为阳性。

3．鉴定-链激酶试验 观察结果：观察凝固块重新完全溶解的时间，完全溶解为阳性，如24小时后不溶解即为阴性。

3．鉴定-其他检验 使用生化鉴定试剂盒或生化鉴定卡对可疑菌落进行鉴定。

4．结果报告 综合以上试验结果，报告每25g（mL）检样中检出或未检出β型溶血性链球菌。

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