分子生物学部分开发实验 植物遗传亲缘关系研究
实验目的 运用PCR-RAPD 分子标记技术,对不同种植物的基因组DNA进行PCR扩增,获得指纹图谱。同时运用统计分析方法,计算不同物种的遗传距离,得出物种间的亲缘关系。
实验材料 植物样品: 花椰菜1,花椰菜2,花椰菜3
实验试剂及仪器 10×buffer: 500mM KCl 100mM Tris-HCl (pH9.0) 0.1% 明胶 0.1% 明胶 1% TritonX-100 MgCl2 2.5mM 4×dNTP: 1mM 引物: 3种RAPD引物 5.0uM 模板: 20ng/μl Taq酶: 5u/μl PCR仪,凝胶成像系统,电泳系统
实验方法 1.向无菌的500μl Eppendorf管中依次加入以下溶液。 反应物 体积 10×buffer 2.5μl 反应物 体积 10×buffer 2.5μl 4×dNTP(1mM) 2.5μl MgCl2 (25mM) 2.5μl 无菌水 10.5μl Taq酶 (1U/ul) 1μl 引物 2μl 模板DNA(20ng) 4μl 总体积 25μl
2.反应体系混匀,离心 3.在PCR仪上按以下方式循环 94℃变性 1分钟 36℃退火 1分钟 72℃延伸 2分钟 经过40个循环 94℃变性 1分钟 36℃退火 1分钟 72℃延伸 2分钟 经过40个循环 4.72℃延伸反应7分钟。 5.取20μl反应液加4μl Loading buffer在 6. 1.5%琼脂糖凝胶上120伏,电泳2小时。 7. 在凝胶成像系统上观察记录实验结
结果分析 根据RAPD扩增结果计算: 1.遗传相似性系数 S S = 2 Nxy / (Nx + Ny) Nxy为种间共有的扩增带,Nx为X种具有的扩增带,Ny为Y种具有的扩增带 2.遗传距离(D) D = 1 - S