病毒及真菌鉴定技术 黄红莹

目的要求 1. 熟悉真菌的培养条件及真菌小培养方法 2. 熟悉白色念珠菌及多细胞真菌的镜下结构 3. 熟悉病毒的培养方法及常用检测技术

实验内容 1. 真菌标本片观察 画图 2. 真菌小培养（示教） 3. 病毒的鸡胚培养法

形态学观察 白色念珠菌： 本菌细胞呈卵圆形，很象酵母菌，比葡萄球菌大5～6倍，G+，但着色不均匀。在病灶材料中常见菌细胞出芽生成假菌丝，假菌丝长短不一，并不分枝，假菌丝收缩断裂又成为芽生的菌丝，有芽生孢子。 4×10倍

形态学观察 青霉菌： 属多细胞，营养菌丝体无色；菌丝和分生孢子梗有横膈；分生孢子梗经过多次分枝，产生几轮对称或不对称的小梗，形如扫帚，成为帚状体；分生孢子大部分呈蓝绿色。

形态学观察 毛霉菌： 直接镜检，可见无隔菌丝，与曲霉菌比较，菌丝较粗大，分枝少，孢子亦不多

真菌的培养 营养要求不高，需氧，pH4.0~6.0，最佳温度为25~30℃，但某些深部真菌为37℃。 培养时间也较久，需1-4周。 沙保弱培养基 长出的菌落分为：酵母型菌落、类酵母型菌落和丝状菌落三种。 双相性真菌 马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei, PM)，在25℃时表现为菌丝相 (mycelial)，37℃时表现为酵母相(yeast)。 培养基因菌落产生的水溶性色素而变成相应颜色，这对于鉴定真菌的种属有重要意义。

真菌小培养 玻片培养又称小培养，小培养法可以随时观察真菌的生长形态(如大分生孢子、小分生孢子及孢子柄等)，还可以随时观察其生长发育的全部情况，有利于菌种的鉴定。  钢环法  (1)材料：白假丝酵母菌、沙保弱培养基、无菌玻片、盖玻片、钢环(带有缺 口)、石蜡。 

(2)方法  ①用无菌镊子取无菌小培养钢环，环的两面分别蘸取熔化的固体石蜡，平置于无菌载玻片上，另取一无菌盖玻片，在酒精灯火焰上加热后覆盖于钢环上，待冷后，小培养钢圈即被固定于载玻片与盖玻片之间。  ②用毛细滴管吸取融化的培养基，从钢环上端孔注入，注入量占容积的1/2即可。  ③培养基冷却凝固后，用接种针挑取材料，由上端孔接种于环内培养基上。 

④置湿盒内，室温或37℃下培养2—3d后，逐日观察，镜下可连续看到真菌生长过程及菌丝、孢子等特征，一般7d左右即可长好。  ⑤也可不用小培养钢环，直接将融化的培养基滴于无菌玻片上，待冷凝后从周边接种材料，用盖玻片覆盖后培养，在显微镜下连续观察生长情况。  (3)结果：镜下观察可见到有胞壁增厚的厚膜孢子及假菌丝。 

病毒感染的快速诊断 （一）形态学检查 电镜和免疫电镜检查 普通光学显微镜检查 包涵体

病毒感染的快速诊断 1.病毒蛋白抗原检测 免疫标记技术 2.病毒核酸检测 核酸扩增技术 核酸杂交技术 基因芯片技术 基因测序 （二）病毒成分检测 1.病毒蛋白抗原检测 免疫标记技术 2.病毒核酸检测 核酸扩增技术 核酸杂交技术 基因芯片技术 基因测序

可诊断急性感染 特异性IgM抗体：孕妇感染风疹病毒 EBV早期抗原抗体 EAV核心抗原抗体 早期抗原的抗体 EAV衣壳抗原抗体 三）早期抗体检测 可诊断急性感染 特异性IgM抗体：孕妇感染风疹病毒 EBV早期抗原抗体 EAV核心抗原抗体 早期抗原的抗体 EAV衣壳抗原抗体

病毒培养技术 1. 细胞培养 2. 鸡胚培养 3. 动物培养

病毒鸡胚培养技术 实验材料 7-11日龄鸡胚 孵卵箱：孵卵箱要有两个，一个39℃，放正常鸡胚用，另一个33-35℃，放接种病毒后的鸡胚。 照明灯，打孔器和卵盘。 其它：注射器，针头，消毒剂(2.5％碘酒和75％酒精)，镊子，酒精灯，试管架，蜡和胶布等。

活胚检查 血管：活胚可见明显的血管，有时可见血管搏动；死胚血管模糊，成淤血带或淤血块。 胎动：活胚可见明显的自然运动，尤其用手轻轻转动卵时。但胎龄大于14天胚胎，胎动则不明显，甚至无胎动；死胚见不到任何胎动，胚发红像出血样，有的呈现黑块。 绒毛尿囊膜发育之界线：生活良好之胚胎可见密布血管的绒毛尿囊膜与鸡胚胎的另一面形成较明显的界线。 必须把上述三方面结合起来进行观察，如果胚胎活动呆滞或不能主动地运动，血管模糊扩张或折断沉落，绒毛尿囊膜界限模糊，则可判断胚胎濒死或已经死亡。

人工气室法 标记：通常选9-11日龄鸡胚，照检后画出气室边界,标出鸡眼位置。 消毒：在记号处及气室中心部先用2.5％碘酒消毒，再用75％酒精脱碘。 打孔：在气室中心部锥小孔。然后用锥子轻锥记号处蛋壳，约0.5mm深，使其卵壳穿孔而壳膜不破。 制作人工气室：用洗耳球吸去气室部空气的同时，随即因上面小孔进入空气而绒尿膜陷下形成一个人工气室，天然气室消失 注射：用注射器注入样品0.2 ml，然后用石蜡溶化封口，置33-35℃培养。 于接种后24 h内死亡者为非特异性死亡应弃去。

绒尿膜接种 针头与卵壳成直角。自上面小孔滴入人工气室约0.1~0.2 mL病毒。

羊膜腔接种 检卵灯照射下能清楚的看到羊膜腔的位置，针头可在鸡胚头部刺入，用针头刺激鸡胚头部，可见鸡头转动，证明已经入羊膜腔，将病毒注入0.2 mL。

尿囊腔接种 鸡胚横卧于卵架上，针孔向上，针头由小孔刺入4~5 mm，注入病毒液0.2 mL。注射完稍停片刻以防回流。

卵黄囊接种 自气室小孔沿鸡胚纵轴向鸡胚胎对面方向刺入接种病毒约0.5 mL。