环境微生物学实验 环境科学实验教学示范中心

《环境微生物学实验》多媒体课件简介 本课程是环境科学、农业资源与环境等专业开设的一门独立的专业基础课实验 ,其宗旨是着重训练学习掌握微生物学最基本的操作技能，如显微镜的使用方法，微生物的基本形态观察，细菌染色技术，土壤、水体、空气中微生物的检测等。了解微生物的基本知识，通过观察具体材料和实验结果以加深理解和巩固课堂讲授的某些环境微生物学理论；同时，通过实验，培养学生观察、思考、分析问题和解决问题的能力。本课件的内容主要包括：荧光原位杂交法检测活性污泥中的硝化细菌、微生物的接种技术、细菌染色及微生物观察，土壤、空气微生物检测、水体中大肠菌群细菌的检测等。

实验一 细菌染色法及微生物的观察

用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋电质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料(如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等)使其着色。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH值下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料．如伊红美蓝、伊红天青等。

简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方法难于辨别细菌细胞的构造。 革兰氏染色法法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G－)和革兰氏阴性菌(G＋)两大类，是细菌学上是常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为G－菌和G＋菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G－菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。G＋菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。

一、实验目的和内容 目的：巩固无菌操作技求，掌握细菌及其结构的染色技术。 内容： 1、学习细菌单染色操作技术。 2、学习革兰氏染色技术。 3、学习细菌的荚膜、芽孢及鞭毛染色方法。

二、实验材料和用具 1、单染色法： （1）大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的斜面菌种。 （2）吕氏美蓝染色液、石炭酸复红染色液、黑色素液或碳素墨水、香柏油、二甲苯、无菌水 （3）显微镜、擦镜纸、接种环、酒精灯、载玻片、吸水纸、无菌牙签。

2、革兰氏染色： （1）黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌（E.coli）菌液，待测菌菌液l～2种； （2）  革兰氏染色液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、95％乙醇、石炭酸复红液等)、 （3） 香柏油、二甲苯；显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、吸水纸、试管、小滴管、酒精灯。

3、荚膜染色： (l)在阿须贝(Ashby)无氮培养基上培养3—5天的团褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)或者培养2—3天的硅酸盐细菌(Bacillus mucilaginosus subsp silicus) (2)李夫森氏染色液、硼酸钠美兰染色液、石炭酸复红染色液、黑色液。 (3)载玻片、接种环、洗瓶。 (4)显微镜。

4、鞭毛染色： (1) 在牛内膏蛋白胨斜面上培养19—24小时的假单孢菌(Pseudomonas.sp)，此培养体在取用前经过每日移植—代，连续移植5～7代。 (2)新配制的费氏及康氏鞭毛染色液A和B。 (3)无菌水、无菌空试管、凹玻片。盖玻片、洁净载玻片、接种环、洗瓶。 (4)显微镜．

5、芽孢染色： (1)在牛肉膏蛋白胨斜面上培养24～36小时的枯草杆菌或者苏云金杆菌。 (2)载玻片、接种环、酒精灯、洗瓶、镊子。 (3)显微镜。 (4)香柏油、二甲苯、擦镜纸． (5)孔雀绿染色液、蕃红染色液。

三、操作步骤 一、单染色法 （1）涂片 在洁净无脂的载玻片中央滴一小滴无菌水（图4－10a），用无菌操作方法从菌种斜面挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成薄膜，涂布面积约1～1.5cm2（图4－10b）。 （2）干燥 将涂片于室温中自然干燥。 （3）固定 手执载片—端，使涂菌的一面向上，将载片通过微火2～3次。在火上固定时，用手摸涂片反面，以不烫手为宜。不能将载片在火上烤，否则细菌形态毁坏(图4—10c)。

（4）染色 将涂片置于水平位置，滴加染色液覆盖于涂菌处，染色约2min(图4—10d)。 （5）水洗 倾去染色液，斜置载片，用自来水的细水流由载片上端流下，不得直接冲在涂菌处，直洗至从载片上流下的水中无染色液的颜色为止(图4—10e)。 （6）干燥 自然晾干或用吸水纸轻轻地吸干，注意不要擦掉菌体(图4—10f)。 （7）待标本完全干燥后，先用低倍镜和高倍镜观察，将典型部位移至视野中央，再用油镜观察。

图4－10 单染色方法

（二） 革兰氏染色法 1、制片 （1 ） 涂菌 用无菌操作方法从试管中沾取菌液一环，用接种环在洁净无脂的载玻片上做一薄而均匀、直径约1cm的菌膜。涂菌后将接种环火焰灭菌。 （2）干燥 于空气中自然干燥。亦可把玻片置于火焰上部略加温加速干燥(温度不宜过高)。 （3）固定 目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上，便于染料着色，常用加热法，即将细菌涂片面向上，通过火焰3次，以热而不烫为宜，防止菌体烧焦、变形。此制片可用于染色。

2、染色 （1）初染：于制片上滴加结晶紫染液，染1min后，用水洗去剩余染料。 （2）滴加卢戈氏碘液，1min后水洗： （3）滴加95％乙醇脱色，摇动玻片至紫色不再为乙醇脱退为止(根据涂片之厚薄需时30s至1min)。 （4）复染 滴加石炭酸复红液复染1min，水洗。 （5）用滤纸吸干，油镜镜检。

3、结果 革兰氏阳性菌染成篮紫色，革兰氏阴性菌染成淡红色。 4、检测未知菌 用以上方法对未知面进行革兰氏染色，并绘图、记录染 色结果。

（三）荚膜染色法 1．石炭酸复红染色 (1)取培养了72h的褐球固氮菌制成涂片，自然干燥(荚膜是多糖类物质，不可用火焰烘干)。 (2)滴入1～2滴95％乙醇固定(不可加热固定)。 (3)加石炭酸复红染液染色1～2min，水洗，自然干燥。 (4)在载玻片一端加一滴墨汁，另取一块边缘光滑的载玻片与墨汁接触，在以匀速推向另一端，涂成均匀的一薄层，自然干燥。 (5)干燥后用油镜观察。菌体红色，荚膜无色，背景黑色。

2．背景染色 (1)先加1滴墨水于洁净的玻片上，并挑少量褐球固氮菌与之充分混合均匀。 (2)放一清洁盖玻片于混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，向下轻压，吸收多余的菌液。 (3)干燥后用油镜观察。背景灰色，菌体较暗．在其周围呈现一明亮的透明圈即荚膜。

3．李夫森氏－硼酸钠美兰染色 （1）取在阿须贝氏无氮培养基上培养3天的硅酸盐细菌少许，制成干燥涂片(不要加热固定)。 （2）加李夫森氏染色液染色l0min，倾之染液(勿用水洗)。 （3）加硼酸钠美兰染色液染色5min，水洗，晾干。 （4）油镜视察可见荚膜被染成红色，菌体处成蓝色。

（四）鞭毛染色法 1．方法一： （1）用接种环由培养18～20h的斜面上取假单胞菌菌体少许，用菌滴制片法检查细菌的运动性。如果菌体的运动性很强，则可作鞭毛染色。 （2）用3～4mL无菌水，将培养体洗下，移入另一无菌试管中，适温培养10min，再检查运动性。

（3）用无菌吸管由悬液上部取一小滴，置于一清洁载玻片的一端，将玻片倾斜。使菌液由一端流向另外一端。于是在玻片上做成2～3条菌液带。待水膜自然干燥（切勿用火焰烘）。 （4）用刚刚过滤的鞭毛染色液A染色5min(不要加热)。 （5）倾去A液，加鞭毛染色液B染色10min。用蒸馏水轻轻冲洗，晾干。 （6）用齐氏石炭酸复红染色2～3min。轻轻冲洗，晾干(不能用吸水纸吸干)。 （7）先用低倍镜，再用高倍镜，最后用油镜检查。

2．方法二： （1）制涂片：先加少量无菌蒸馏水于凹载玻片的凹窝中．再从培养10h左右的斜面菌苔上取菌一环，轻放在凹窝水面上(不要搅动)，放30度温箱静置5～10min．取出，从凹窝水面上轻轻取菌液一环，轻放在干净的载玻片上(不要涂抹)，放回温箱，让其自然干燥(不要加热固定)。 （2）染色：在自然干燥的涂片上，滴加含石炭酸的鞭毛染色液一滴，染色5min，用水轻轻冲洗，让其自然干燥。 （3）镜检：用油镜观察。

（五）芽孢染色法 1．方法一： (1)取37℃培养18～24h的枯草芽孢杆菌作涂片，并干燥，固定。 (2)于载片上滴人3～5滴5％孔雀绿水溶液。 (3)用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热，自载玻片上出现蒸汽时，开始计算时间约4～5min。加热过程中切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料。 (4)倾去染液，待玻片冷却后，用自来水冲洗至孔雀绿不再褪色为止。 (5)用0.5％沙黄水溶液(或0.05％碱性复红)复染1min，水洗。 (6)制片干燥后用油镜观察。芽孢呈绿色，菌体红色。

2．方法二： (1)加1～2滴自来水于小试管中，用接种环从斜面上挑取2～3环培养18～24h的枯草芽孢杆菌菌苔于试管中，并充分均匀打散，制成浓稠的菌液。 (2)加5％孔雀绿水溶液2～3滴于小试管中．用接种环搅拌使染料与菌液充分混合。 (3)将此试管浸干沸水浴(烧杯)中，加热15～20min。 (4)用接种环从试管底部挑数环菌于洁净的载玻片上，并涂成薄膜，将涂片经过微火3次固定。 (5)水洗，至流出的水中无孔雀绿颜色为止。 (6)加沙黄水溶液，染2～3min后，倾去染液，不用水洗。 (7)干燥后用油镜观察。芽孢绿色，菌体红色。

四、注意事项 1．载玻片要洁净无脂，否则菌液涂不开。涂片时，滴水不要过多，挑菌量宜少，菌膜宜薄，切忌过厚。 2．在染色过程中，不可使染液干涸。 3.在革兰氏染色过程中脱色时间十分重要，过长，则脱色过度，会使阳性菌被染成阴性菌，另外，老龄菌因体内核酸减少，会使阳性菌被染成阴性菌，故不能选用。 3.荚膜染色涂片不要用加热固定，以免荚膜皱缩变形。 4.鞭毛染色液最好当日配置，次日使用则鞭毛染色浅，观察效果差。染色时一定要充分洗净A液后再加B液，否则背景不清晰。 5．供芽孢染色用的菌种应控制菌龄，使大部分芽孢仍保留在菌体上为宜。

五、实验报告 (一)绘图 1．单染色后观察到的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的形态图。 2．大肠杆菌革兰氏染色视野图。 3．金黄色葡萄球菌革兰氏染色视野图。 4．褐球固氮菌菌体及荚膜的形态。 4．绘出你所观察到的细菌的形态及鞭毛着生情况。 6．枯草芽孢杆菌及巨大芽孢杆菌的菌体及芽孢形态，芽孢的着生位置。 (二)单染色法操作要点。 (三)记录革兰氏染色法法步骤，并进行结果分析。

六、问题和思考 1．涂片在染色前为什么要先进行固定?固定时应注意什么问题? 2．制备染色装片时应注意哪些事项，为什么?制片为什么要完全干燥后才能用油镜观察？ 3．什么是革兰氏染色法?染色过程应注意什么? 4．试分析革兰氏染色法在细菌分类中的意义。 5．组成荚膜的成分是什么?涂片一般用什么固定方法，为什么? 6．鞭毛染色的菌种为什么要先连续传几代，并且要采用幼龄菌种? 7．根据你的实验体会，哪些因素影响鞭毛染色的效果?如何控制?

实验二 微生物的接种技术

微生物接种技术是进行微生物实验和相关研究的基本操作技能。 无菌操作是微生物接种技术的关键。斜面接种、液体接种、固体接种和穿刺接种操作均以获得生长良好的纯种微生物为目的。 由于接种方法不同，采用的接种工具也有区别，如固体斜面培养体转接时用接种环；穿刺接种时用接种针，液体转接用移液管等。

一、实验目的： 了解各种微生物接种方法： 斜面接种技术 液体接种技术 固体接种技术 穿刺接种技术

二、实验材料和用具： 已灭菌培养基、接种环、接种针、酒精灯、移液管、记号笔

三、实验步骤： 1、斜面接种技术 斜面接种是从已生长好的菌种斜面上挑取少量菌种移植 至另一新鲜斜面培养基上的一种接种方法。具体操作如下： 斜面接种是从已生长好的菌种斜面上挑取少量菌种移植 至另一新鲜斜面培养基上的一种接种方法。具体操作如下： (1)贴标签 接种前在试管上贴上标签，注明菌名、接种日期、接种人姓名等。贴在距试管口约2～3cm的位置。(若用记号笔标记则不需标签)。 。

(2)点燃酒精灯。 (3)接种 用接种环将少许菌种移接到贴好标签的试管斜面上。操作必须按无菌操作法进行。简述如下： 1)手持试管 将菌种和待接斜面的两支试管用大姆指和其他四指握在左手中．使中指位于两试管之间部位。斜面面向操作者，并使它们位于水平位置。

2)旋松管塞 先用有于松动棉塞或塑料管盖，以便接种时拔出。 3)取接种环 右手拿接种环，在火焰上将环端灼烧灭菌．然后将有可能伸入试管中的其余部分均灼烧灭菌，重复此操作．再灼烧一次。 4)拔管塞 用右手的无名指、小指和手掌边先后取下菌种管和待接试管的管塞，然后让试管口缓缓过火灭菌(切勿烧得过烫)。见图4—6(a)所示。

图4－6 试管拔塞后过火灭菌和取菌

8)塞管塞 取出接种环，灼烧试管口，并在火焰旁将管塞旋上。不要用试管去迎棉塞，以免试管在移动时纳入不洁空气。 9)将接种环灼烧灭菌。放下接种环，再将棉花塞旋紧。

2、液体接种技术 (1)用斜面菌种接种液体培养基时，有下面两种情况：如接种量小，可用接种环取少量菌体移入培养基容器(试管或三角瓶等)中，将接种环在液体表面振荡或在器壁上轻轻摩擦把菌苔散开，抽出接种环，塞好棉塞，再将液体摇动，菌体即均匀分布在液体中。如接种量大，可先在斜面菌种管中注入定量无菌水．接种环把菌苔刮下研开，再把菌悬液倒入液体培养基中，倒前需将试管口在火焰上灭菌。 (2)用液体培养物接种液体培养基时，可用无菌的吸管或移液管吸取菌液接种。

3、固体接种技术 固体接种最普遍的形式是接种固体菌制剂。因所用菌种或种子菌来源不同分为： 1)用菌液接种固体料 可用菌苔刮洗制成的悬液。接种时可按无菌操作法将菌液直接例入固体培养基中，搅拌均匀。注意接种所用菌液量要计算在固体料总加水量之内，否则往往在用液体种子菌接种后含水量加大，影响培养效果。 2)用固体种子接种固体料 包括用孢子粉、菌丝孢子混合种子菌或其他固体培养的种子菌，直接把接种材料混入灭菌的固体料。接种后必须充分搅拌．使之混合均匀。

4、穿刺接种技术 穿刺接种技术是一种用接种针从菌种斜面上挑取少量菌体并把它穿刺到固体或半固体的深层培养基中的接种方法。经穿刺接种后的菌种常作为保藏菌种的一种形式，同时也是检查细菌运动能力的一种方法，它只适宜于细菌和酵母的接种培养。具体操作如下： (1)贴标签。 (2)点燃酒精灯。

(3)穿刺接种，方法如下： 1)手持试管。 2)旋松棉塞。 3)右手拿接种针在火焰上将针端灼烧灭菌，接着把在穿刺中可能伸入试管的其他部位也灼烧灭菌； 4)用右手的小指和手掌边拔出棉塞。接种针先在培养基部分冷却．再用接种针的针尖沾取少量菌种。

5)接种有两种手持操作法。一种是水平法，它类似于斜面接种法。一种则称垂直法，如图4—8所示。尽管穿刺时手持方法不同，但穿刺时所用接种针都必须挺直，将接种针自培养基中心垂直地刺入培养基中。穿刺时要做到手稳、动作轻巧快速，并且要将接种针穿刺到接近试管的底部，然后沿着接种线将针拔出。最后，塞上棉塞，再将接种针上残留的菌在火焰上烧掉。 (6)将接种过的试管直立于试管架上，放在37℃或28℃恒温箱中培养。24h后观察结果(注意：若具有运动能力的细菌，它能沿着接种线向外运动而弥散，故形成的穿刺线较粗而散、反之则细而密)。

图4－7斜面划线法（a）和不同细菌直线接种长出的菌苔形态（b）

图4－8 穿刺接种：（a）水平穿刺接种；（b）垂直穿刺接种

四、实验报告 列表比较各种接种方法及注意事项。

五、问题和讨论 1.斜面接种取菌前为什么要将灼烧过的接种针在无菌培养基上沾一下？ 2. 穿刺接种时能否将接种针直接穿透培养基？

实验三 荧光原位杂交法检测活性污泥中的硝化细菌 Detection of Nitrifying Bacteria With Fluorescence In Situ Hybridization

一、实验目的 1、通过本次实验掌握荧光原位杂交技术的 原理及操作方法； 2、通过本次实验了解硝化细菌在活性污泥生物膜中的分布和数量。

二、实验原理 原位定性、定量及相对定位检测特定核酸序列的技术。 杂交所用探针最早用位素作标记，后来改用荧光作标记，称为荧光位杂交（FISH， Fluorescence in situ hybridization ）。 杂交技术(in situ hybridization)，1969年由Pardue和John等人发明，是在玻片或纤维膜上以标记的单链核酸为探针，与组织或细胞中的特定DNA序列进行杂，通过标记信号的有无及强弱来定性、定量及相对定位检测特定核酸序列的技术。

硝化细菌有亚硝酸细菌和硝酸细菌。 亚硝酸细菌的探针：NSO190，5’-CGATCCCTGCTTTTCTCC -3’ FAM 标记（绿色）。 硝酸细菌的探针：NIT3 5’-CCTGTGCTCCATGCTCCG- 3’ HEX标记（蓝色）。 竟争性探针：CNT3 5’-CCTGTGCTCCAGGCTCCG-3 ’

三、主要实验材料

主要试剂 探针、1%稀盐酸、双蒸水、丙酮、2%硅烷丙酮、明胶、明矾、PBS，4%多聚甲醛、NaOH，50%、60%、70%、80%及96%的乙醇，荧光素HAM、HEX、杂交液。

四、操作步骤 1.玻片预处理 （1）、一般处理 热肥皂水洗 自来水冲洗12-15次 蒸馏水冲3次 1%盐酸中浸泡24h 双蒸水冲3次 121度灭菌20分钟。 （2）硅化处理 70%乙醇洗1分钟 丙酮浸泡1分钟 2%硅烷丙酮浸泡10S 丙酮浸泡10S 蒸馏水浸泡10S 双蒸水冲3次 50℃烘干 2.样品预处理 涂片：活性污泥生物膜样品直接涂布于硅化处理后的玻片上。 热固定：50 ℃烘2h。 脱水：固定后样品于50%、60%、70%、80%及96%的乙醇脱中室 脱水3min。

3.杂交反应 原位杂交反应：10uL探针+90uL杂交液，混匀后取5-10uL加到预处理过的样品上，暗盒中46℃杂交2-3h。 探针的清洗：取出玻片，放入50mL探针清洗液，48 ℃浸泡20min。双蒸水室温下漂洗2-3次。空气中风干。 4.镜检：用荧光显微镜观察，采用蓝色和绿色滤光片。拍照。

五.实验的注意事项 1.严格处理玻片：玻片的预处理应严格按操作步骤来做，避免有残留的核酸。 2.设对照：将实验室富集培养的硝化细菌经过充分分散，稀释1000倍，取样50ul，与亚硝化细菌探针杂交。

六、思考题 1.荧光原位杂交的原理是什么？ 2.进行本实验要注意哪些事项？

附录一.杂交液的配制 探针 杂交液 去离子甲酰胺/% SDS/ % Tris-HCI，PH7.2/mol/L NaCI/mol/L ISO190 55 0.01 20 0.9 NIT3 40 CNIT3

附录二.探针清洗液配制 20mmol/L Tris –HCI(PH7.2),0.01%SDS,5mmol/L EDTA,40mmol/LNaCI,56mmol/L探针溶液（ NIT3探针）

实验四 水中大肠菌群(Coliform group)细菌的检测

一、实验目的 了解大肠菌群的检测方法。

二、材料与器皿 (—)培养基 1、普通乳糖蛋白胨培养液 蛋白胨 10g 牛肉膏 3g 乳糖 5g 氯化钠 5g 1.6％溴甲酚紫乙醇液 1.0mL 蒸馏水 1000mL pH 7.2~7.4

将蛋白胨、牛肉膏、乳糖、氯化钠加热溶解于1000mL蒸馏水中，调节pH为7. 2~7. 4，再加入1. 6％溴甲酚紫乙醇液1 将蛋白胨、牛肉膏、乳糖、氯化钠加热溶解于1000mL蒸馏水中，调节pH为7.2~7.4，再加入1.6％溴甲酚紫乙醇液1.0mL，充分混匀，分装于有杜汉氏小管的试管中，每管10mL，115℃灭菌20min。 2、三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液 按上述普通乳糖蛋白胨培养液浓缩三倍配制，分装于有杜汉氏小管的试管中，每管5mL。

3、品红亚硫酸钠培养基（供平板分离用） 蛋白胨 10g 乳糖 10g K2HPO4 3.5g 琼脂 15～20g 蒸馏水 1000mL 无水亚硫酸钠 5g左右 5％的碱性品红乙醇溶液 20mL pH 7.2~7.4

4、伊红美蓝培养基（EMB培养基）（供发酵法平板分离用，3和4可任选一种） 蛋白胨 10g 乳糖 10g K2HPO4 2.0g 琼脂 20g 蒸馏水 1000mL 2％伊红（曙红）水溶液 20mL 5％美蓝（亚甲蓝）水溶液 13mL pH 7.2~7.4

(二)灭菌移液管、灭菌稀释水、试管、杜汉氏小管、革兰氏染色液、灭菌培养皿。

三、方法与步骤 (一)水样的采集 供细菌学检验的水样，必须按一般无菌操作的基本要求采集，并保证再运送、贮存过程中不受污染。水样从采集到检验不应超过4小时，在0～4℃下保存不应超过24小时，如不能在4小时内分析，应在检验报告上注明保存时间和条件。

（1）自来水取样：应在水龙头打开放水5分钟，再用无菌容器接取水样，待分析。如水样内含有余氯，则采样瓶灭菌后按每500mL水样加3％Na2S2O3.5H2O溶液1mL。 江、河、湖、池自然水体取样：可用采样器，采样瓶应先灭菌。采样后，瓶内应留有空隙。如果与其他化验项目联合取样，细菌学分析水样应采在其他样品之前。

（二）初发酵试验 水样稀释：制备水样10-1、10-2的稀释液，方法为用无菌移液管吸取水样10mL放于盛有90mL无菌水和若干玻璃珠的锥形瓶中，充分振荡使混合均匀，并使其中的细菌尽量呈单个存在，即为10-1稀释液；再从10-1制备10-2稀释液。以此类推，稀释到所需倍数。

 （2）接种和培养：以无菌操作于5支三倍浓缩培养基（接种前一定应先检查杜汉氏小管内有无气泡）中各加入水样10mL，5支普通培养基试管中加入水样1mL，5支普通培养基试管中加入10-1稀释液1mL， 小心混匀放入37℃培养箱中培养24小时。此即5管法。 （3） 结果观察：37℃中培养24h后取出观察，观察有无气体（杜汉氏小管内有无气体）和酸产生（培养基有无变色）。在48h之间，培养管内倒置的杜汉氏小管内有任何量的气体积累，或培养基颜色从紫色变为黄色，便可初步断定为阳性反应。

若实验所测定的15支管中均为阳性反应，说明浓水样污染严重，可将样品进一步稀释后，再按上述方法接种、培养和观察。 (三)平板培养试验 将初发酵实验中产酸产气的后只产酸或只产气的试管中的培养物用接种环取少许，划线接种在品红亚硫酸钠培养基或伊红美蓝培养基平板上，为了确保获得分离的单菌落，须注意以下事项：

（1）划线间距至少相隔0.5厘米； （2）接种钉尖端要稍弯； （3）先对试管轻击并使之倾斜，以免接种针挑取到任何膜状物或浮渣； （4）划线时要用针尖的弯曲部分接触琼脂培养基平面．以免刮伤或戳破培养基。划线后培养皿倒置，于37℃培养18～24h。 24h后，观察在平板上出现的单个菌落，其核心有深绿色金属光泽者为较典型的大肠菌群菌落。尽可能挑取典型的或接近典型的大肠菌群菌落，在营养琼脂斜面上划线，置37℃培养24h。挑取斜面培养物制成涂片，进行革兰氏染色，凡属革兰氏阴性杆菌，即确认了大肠菌群细菌的存在．

(四)复发酵验证实验 经上述经染色为革兰氏阴性的典型菌落，用接种环刮取部分接种于盛有乳糖培养基的试管中，在37℃培养24h，阳性反应者即确认为大肠菌群细菌。

四、结果计算 在初发酵试验中，可能有极少数能发酵乳糖产气的非大肠菌群细菌混在阳性可疑反应管中，通过对初发酵中的阳性可疑管进行平板和复发酵试验，并进行革兰氏染色和细菌形态的观察，可将那些少量的非大肠菌群细菌(“假阳性管”)删除去，故在记录时只能把三步试验都呈阳性的试管计入阳性反应管。

如果初发酵接种水样量为10mL、1mL、0.1mL，可直接查表4－2求出原水样100mL中大肠菌群指数（MPN）。如果接种水样量低于上述水样量，则经下面的换算式计算。

表4－2水样的总大肠菌群检索表 出现阳性反应的试管数 每100ml中的细菌的MPN 10ml管中 1ml管中 0.1ml管中 1 2 3 4 1 2 3 4 5 7 9 6 11 13 15 8 17 10 12 19

五、实验报告 1、 简述实验过程。 2、计算实验结果。

六、问题与思考 实验过程中有什么问题，你认为原因何在，如何克服？

实验五 土壤及空气中微生物的检测

一.试验目的 1. 学会土壤微生物的检测方法，了解土壤中微生物的数和组成。 2. 了解一定环境空气中微生物的分布情况，学习并掌握检定和计数空气微生物的基本方法。 (注:每组两人)

二、材料和仪器 (—)培养基 1.肉膏蛋白胨琼脂培养基（培养细菌） 2.高氏一号琼脂培养基（培养放线菌） 3.查氏培养基（培养霉菌） (二)灭菌稀释水、灭菌吸管、灭菌培养皿。 (三)土壤样品、天平、称重纸。 （四）恒温箱、气体流量计

三、方法和步骤 （一）土壤微生物检测 (1)土壤样品的连续稀释 取新鲜土壤样品1g，在酒精灯火焰旁加到一个装有99mL无菌水的锥形瓶中（锥形瓶内装有几个玻璃珠），将锥形瓶依左右方向振荡数十次使土与水充分混合，将菌分散，即为10-2mL菌液。然后将菌悬液进一步稀释。一直稀释到合适的稀释倍数（使接种1mL菌液的培养皿平板上出现30～300个菌落。 (2)根据样品中各种微生物的数量选择合适的稀释度，每种选择三个稀释度，每个稀释度设两个重复。 选择出合适的稀释度后，用移液管将悬液1mL转移到培养皿中。

（3）将已灭菌的培养基融化后冷却至45℃（温度过高，培养皿盖上凝结水太多，菌易被冲掉；温度过低，则培养基凝固，不易倒出）。右手拿培养基，左手把皿盖打开一小缝倾入培养基15～20mL，迅速盖皿盖，平放桌上，轻轻旋转，使培养基和土壤悬浮液充分混匀，凝固后，制成平板，将培养皿倒置于培养箱中培养。 （4）分离放线菌时，在制备平板前在培养基中加入5％的酚溶液2滴，以抑制细菌生长，于25～30℃培养箱中培养7～10天观察。 霉菌分离，在制备平板前在培养基中加入80％的乳酸数滴，于25～30℃培养箱中培养3～4天观察。 细菌在37℃培养24小时观察（见图4－12）

图4－12 细菌菌落形态。（a）肉眼观察的细菌菌落形态的多变性。菌落总体形状和边缘状况可由菌落上方俯视观察。而菌落高度则由平板边缘水平观察。

（二）空气中微生物的检测 1、沉降法 (1)将肉膏蛋白胨琼脂培养基、查氏琼脂培养基、高氏一号琼脂培养基溶化后，各倒四个平板。 （2）将上述三种培养皿各取二个，在室外打开皿盖，分别暴露于空气中5分钟、10 分钟。另二个培养皿在实验室空气中分别暴露5分钟、10分钟。 （3）肉膏蛋白胨平板于37℃，倒置培养1天；查氏琼脂平板和高氏一号琼脂平板倒置于28℃培养分别培养3～4天和7～10天后各自计算其菌落数，观察菌落形态、颜色。

（4）计算每m3空气中微生物的数量。 奥梅梁斯基曾建议：面积为100cm2的平板培养基，暴露在空气中5分钟相当于10升空气中的细菌数。计算公式如下：

2、筛孔采样法 将四个细菌培养基平板和采样仪器带到受试环境，开启采样仪，调好空气流量，根据流量确定采样时间，关上电源。 将细菌培养基平板放入采样器中，调好采样时间后立即接通电源。到时后，取出平皿，并立即盖好皿盖。 将平板放于培养箱内37℃培养1天，观察计数平皿中的菌落数。 根据下式计算1m3空气中细菌数。 式中X为1m3空气中的细菌数；N为平皿上的平均菌落数；L为采样空气体积（升）。

四、结果与分析 土壤 1、根据平皿上菌落数与平皿内土壤悬液的稀释倍数算得每g土壤中微生物的数量，注意事项请参阅“水中细菌总数的检测”实验。 2、选择刚好能把细菌分开，而稀释倍数最低的平板（一般含菌落30～300个）计算每克土样中微生物的数量：

3、填写表4-3 表4-3 土壤中菌落情况 菌落特征 菌落名称 生长形状 菌落光泽 表面光泽 与培养基的结合程度 培养温度 培养时间 细菌 放线菌 霉菌

根据沉降法，记录空气中微生物的种类和相对数量，填写表4-4，推算出1m3空气中细菌数。 表4-4 空气中微生物的种类和数量 菌落数 环境 细菌 霉菌 放线菌 室内 5’ 10’ 室外

五、问题与讨论 1.用稀释法进行微生物计数时，怎样保证准确并防止污染？ 2.为什么在霉菌计数时要加入几滴80％的乳酸？加在什么 地方？ 3.为什么在放线菌计数时要加入5％的酚？加在什么地方？ 4.比较空气微生物检测两种方法的优缺点。