第二讲 正常和肿瘤组织细胞培养 温州医学院检验医学院 陶志华

内 容 正常组织细胞培养 上皮细胞的体外培养 血管内皮细胞的体外培养 肾小管上皮细胞的培养 巨噬细胞的培养 淋巴细胞的培养 肿瘤细胞培养

上皮组织的体外培养

上皮细胞的基本特征： 1.上皮组织的形态结构 群体依赖性（population dependence) 2.上皮细胞的极性 接触抑制（contact inhibition) 2.上皮细胞的极性 贴壁依赖性细胞-贴壁生长 生长基质 3 . 上皮细胞间的连接

体外培养的上皮组织细胞的生长生物学 1. 形态学结构： 均质性、透明性很强，结构不明显

a. 防范微生物污染 M199 RPMI1640 DMEM Fam F12 2. 体外培养上皮组织的生长与增殖特征 2. 体外培养上皮组织的生长与增殖特征 (1) 体外培养的特殊条件： a. 防范微生物污染 b. 生长基质的基质 c. 特殊的培养基 M199 RPMI1640 DMEM Fam F12 无血清培养基 d. 去成纤维细胞

(2) 体外培养上皮细胞的形态学变化

(3) 体外培养上皮细胞的生存状态 细胞增殖态 细胞分化态 体内：机体自身神经和内分泌因素 体外：促细胞增殖因子和促细胞分化因子

体外培养上皮组织细胞的观察与检测 光镜： 1. 一般形态学观察 形态、轮廓、生长情况等。 细胞规则、明亮而饱满、细胞轮廓不清 电镜： 桥粒、形态结构特征、细胞间关系 培养液pH变化： 颜色变化？ 培养物的污染情况： 透明度变化？

2. 组织化学与免疫组织化学观察与检测 酶类： 碱性磷酸酶 琥珀酸脱氢酶 特异性抗原标记物： 角蛋白、上皮细胞膜抗原 2. 组织化学与免疫组织化学观察与检测 酶类： 碱性磷酸酶 琥珀酸脱氢酶 特异性抗原标记物： 角蛋白、上皮细胞膜抗原 VIII因子、晶体蛋白、唾液酸糖蛋白

血管内皮细胞的体外培养

人脐静脉内皮细胞的培养 1.主要材料： 组织来源： 婴儿脐带 培养用液： M199+20%FCS D-Hanks 0.1%胶原酶溶液 组织来源： 婴儿脐带 培养用液： M199+20%FCS D-Hanks 0.1%胶原酶溶液 培养用具：

2.培养方法： 分离细胞培养法

5.讨论： (1) 关于接种材料的制备 取材与消化 传代去除法 (3) 关于培养液 (2) 排除成纤维细胞 (4) 关于传代培养 消化酶、浓度、时间 (2) 排除成纤维细胞 传代去除法 加肝素培养法(90u/ml) 刮除法 (3) 关于培养液 (4) 关于传代培养

6. 内皮细胞的鉴定： (1) 光镜检查 (2) 透射电镜检查： W-P小体 (3) VIII因子相关抗原的免疫组化检测

肾小管上皮细胞的培养

1. 主要材料： a. 细胞来源： b. 无血清培养液： 基础培养液： DMEM/HamF12(1:1) 添加物： 胰岛素 5g/ml 氢化可的松36ng/ml T3 4 ng/ml EGF 10  g/ml

c. 消化液： 0.2%胰蛋白酶 d. 细胞筛网： 80和100目

2.原代培养： 切取1cm3外层肾皮质、剪碎成1mm3 80目研磨冲洗、于100目上收集肾小管节段 0.2%胰蛋白酶消化、调整细胞数 接种于纤维连接蛋白包被的培养瓶进行培养 每隔3~4天，更换培养液

3.传代培养： 4. 培养结果： 3d 长出细胞 5~7d 进入对数生长期 7~9d 融合成单细胞层 5.鉴定： 抗角蛋白抗体染色（+）

6.注意事项： a. 分离方法： b. 鉴定方法：

巨噬细胞的培养

巨噬细胞的培养 动物： 小鼠、大鼠、兔、人 培养基： Eagle 常用的巨噬细胞： 肺泡和腹腔巨噬细胞 MEM RPMI1640 HamF12 常用的巨噬细胞： 肺泡和腹腔巨噬细胞

获取巨噬细胞的方法 （一）肺泡巨噬细胞 支气管肺泡灌洗法 （二）腹腔巨噬细胞 1. 小鼠腹腔巨噬细胞的获取： (1)主要材料： 支气管镜肺泡灌洗法 （二）腹腔巨噬细胞 1. 小鼠腹腔巨噬细胞的获取： (1)主要材料： 实验动物: 6周龄小鼠 培养液： 10%FCS RPMI1640

巨噬细胞的纯化 1、原理： 巨噬细胞黏附能力强、贴壁快特点 贴附培养时间 贴附培养温度 2. 方法： 常规差速黏附处理： 低温差速黏附处理：

巨噬细胞的接种和培养 （二）实验步骤： a. 冷分离 （一）主要材料： 培养液： RPMI1640 等+10~40%FCS+抗生素 b. 调整细胞浓度：2~4×106/ml c. 接种培养

（三）培养结果： 大 小： 20~50m 形 态： 菱形、星形、圆形 功 能： 吞噬功能 增殖情况： 不增殖、存活1~3周

（四）巨噬细胞的鉴定 1. 吞噬实验： 加入0.001M(final con.)SiO2 吞噬泡 2. 抗胰蛋白酶消化能力试验： 0.25%胰蛋白酶消化20min、再用吸管反复吹打 细胞变园但不脱落 3. 细胞化学试验： ACP酶染色：棕黑色 NSE酶染色：紫蓝色

淋巴细胞的培养

各类淋巴细胞的主要特征 T淋巴细胞： 表面标志： 1.表面受体： TCR SRBC R Fc R MR Measles viruse R

2. 表面抗原 MHC CD

B淋巴细胞 1. 表面受体 BCR 2. 表面抗原 MHC抗原 FcR CR 丝裂原受体 EBV R CD抗原（CD19、20、 21、23、45）

血淋巴细胞的分离 （一）单个核细胞的分离 密度梯度离心法

（二）纯淋巴细胞的制备 1. 玻璃黏附法 2. 羰基铁粉法

（三）T、B淋巴细胞的分离 1. T细胞花环沉降法 2. 尼龙毛柱分离法

（四）大颗粒淋巴细胞的分离 （五）FACS仪分离 （六）免疫磁珠法

三、血淋巴细胞的体外培养应用

（一）淋巴细胞转化试验 （二）B细胞产生Ig的检查 （三）T细胞介导的细胞毒试验 （四）NK细胞毒性试验 （五）K细胞毒性试验 （六）LAK细胞的制备 （七）TIL细胞的制备

（八）淋巴细胞的体外长期培养 1. 用IL-2建立T淋巴细胞克隆 2. 用EB病毒转化B淋巴细胞 3. 用B细胞生长因子建立B淋巴细胞株

肿瘤细胞体外培养

肿瘤细胞在体外的生长生物学特性 1、肿瘤细胞永生性的保持 2、形态学变化 3、细胞具有更高的增殖能力 4、细胞表面形状的改变 5、接触抑制减弱或消失 6、悬浮生长特性 7、成瘤性的特性

肿瘤细胞体外培养常用的培养基 （一）培养液的种类和选择 RPMI1640+10~20%FCS+0.03%谷氨酰胺： 上皮性癌细胞或悬浮性肿瘤细胞 DMEM、199、MEM： 肉瘤细胞的培养 F12、L-15: 上皮性癌细胞的培养（如肝癌细胞） 加: 2 g/L NaHCO3 20 mmol/L HEPES

（二）培养液特殊添加剂 常用的促细胞生长因子及使用的终浓度 添加剂 终浓度 BSA 10-5 mol/ml TRF 5~10 ug/ml 添加剂 终浓度 BSA 10-5 mol/ml TRF 5~10 ug/ml Insulin 5 ug/ml 氢化可的松 10-6mol/ml EGF 5 ng/ml FGF 5 ng/ml NGF 5 ng/ml

肿瘤组织细胞的原代培养 （一）取材 转移癌标本？ 原发癌标本？

激光捕获显微切割技术 Laser Capture Microdissection，LCM 组织形态学： 识别目的细胞 成功捕获细胞 目的分子的完整性

原 理

目的细胞获取：

（二）植块培养法 建立细胞培养档案： 病理切片、免疫组化、HE染色。 步 骤：

（三）分散细胞培养法 1、组织细胞分离： 机械分散法 胶原酶分散法 2、 接种密度： 1×106/ml 4~5ml/25cm2培养皿或培养瓶

（四）含肿瘤细胞的体液培养法 (五）原代培养的一般结果： 成纤维细胞的生长 淋巴细胞 巨噬细胞 上皮性癌细胞 植块周边的细胞 细胞间隙

（六）去除成纤维细胞的方法 1、刮除法 2、差速黏附法 3、酶消化法 4、磁珠法细胞分选

（七）注意事项： 1、不同培养方法的生长情况 2、传代： 3、原代培养过程中避免污染和耐心操作

二、肿瘤细胞的传代 （一） 首次传代 （二）继续传代

肿瘤细胞的克隆培养法 1、集落克隆法： a. 不锈钢圈法 2. 单个细胞克隆培养法 a. 有限稀释法 b. 滤纸法 c. 吸管吹打法

肿瘤细胞体外生长的形态学与细胞学特征 1、 形态学特征： 2、肿瘤细胞生长曲线和倍增时间

肿瘤细胞的核型和异常生长特性 1. 染色体数目及核型 2. 永生性 3. 异质性 4. 动物接种成瘤性

细胞系的鉴定 （一）细胞系鉴定的内容： 2、细胞系的稳定性 3、细胞学特征 4、微生物污染检测 5、染色体稳定性 1、鉴定细胞系的纯度 2、细胞系的稳定性 3、细胞学特征 4、微生物污染检测 5、染色体稳定性 6、有无细胞系（株）交叉污染

（四）细胞系的同工酶谱分析 1、用途： a、种属来源 LDH G6PD NP b、细胞特征的指标 c、恶化程度的指标

2、检测方法： 动力学法 电泳区分法 层析法 电聚焦分离法 免疫法

已建立细胞的鉴定、管理和使用 组织起源和已传代数 冻存液 细胞活力 培养液：培养基、血清、抗生素等 溶解后细胞生长特征 接种存活率 细胞形态

肿瘤细胞培养的应用 一、肿瘤细胞对组织浸润的体外研究 二、人恶性肿瘤细胞的动物移植瘤研究 三、肿瘤细胞的体外分化实验 四、培养肿瘤细胞的凋亡诱导研究 五、肿瘤细胞的体外化疗药物敏感性实验 六、肿瘤发病机制研究

基本思路： 标本处理？ 肿瘤组织 肿瘤癌旁组织和正常组织 基因芯片技术 SAGE技术 （cDNA miRNA） 基因差异表达分析 SiRNA技术 肿瘤相关基因 基因定量检测研究 基因功能研究 肿瘤早期诊断和治疗监测 肿瘤治疗靶点

基因芯片 miRNA芯片 cDNA芯片 甲基化芯片 固相芯片 液相芯片

TaqMan® MicroRNA Arrays 液相芯片技术 TaqMan® MicroRNA Arrays 实时荧光PCR技术 微量反应体系 ABI 7900

SAGE技术 （serial analysis of gene expression)

SAGE的原理

miRNA 检测技术与应用

microRNA研究现状

小RNA研究—Hot topics in the world 2000年，RNAi的研究进展被Science杂志评为重大科技突破。 2001年，RNAi作为当年最重要的科学研究成果之一，再次入选“十大科技突破”。 2002年12月20日，Science杂志将“Small RNA & RNAi”评为2002年度最耀眼的明星。同时，Nature杂志亦将Small RNA评为年度重大科技成果之一。 2003年，microRNA的研究第四次入选“十大科技突破”，排在第四位。 2005年，microRNA的研究第五次入选“十大科技突破”。 RNA研究的突破性进展，是生物医学研究领域近20年来，可与HGP相提并论的最重大成果之一。

miRNA的产生与功能 1.在细胞核内转录成前体转录本miRNA 2.被RnaseⅢ核酸酶Drosha加工成约70- 90nt的发夹状pre-miRNA 3.转运到细胞质被Dicer加工成成熟miRNA 4.双链miRNA分子被解链，单链的miRNA 进入一个核糖蛋白复合体miRNP(RISC) 5.通过与靶基因的3’ UTR 区互补配对，指导 miRNP复合体对靶基因mRNA 进行切割 或者翻译抑制

microRNA 成熟的MicroRNA(miRNA)是一种22个 nt左右的内源性单链小分子RNA 由带茎环结构的双链RNA前体剪切而成 具有高度保守性、时序性和组织特异性 通过与特异mRNA结合，抑制目标基因表达或降解mRNA 调节人类三分之一的基因

miRNA在动物与植物中的功能 （1）发育 （2）细胞死亡(Baehrecke, 2003) （3）疾病 Timing (Lee et al. 1993) Cell proliferation (Brennecke et al. 2003) Stem cell & neuron (Krichevsky et al. 2003; Hatfield et al., 2005) （2）细胞死亡(Baehrecke, 2003) （3）疾病 肿瘤(Lu et al. 2005) 原癌miRNA(He et al. 2005) 脑肿瘤(Ciafre et al. 2005; Chan et al. 2005) 白血病(Calin et al. 2002; 2004) 糖尿病(Poy et al. 2004) （4）胆固醇的生物合成(Krutzfeldt et al. 2005) （5）DNA 甲基化与染色质修饰(Bao et al. 2004)

miRNA检测的技术挑战 Northern Blot (杂交法) Microarrays (芯片法) 常规方法，易于操作 需大量样品(ug级) 动力学范围低（约2个数量级） 错配杂交问题，难以区分通常只有很少序列差别的序列 Microarrays (芯片法) 通量高 可测动力学范围较宽 需大量RNA样品，约5μg per array 很难区分前体miRNA和成熟miRNA 对类似结构的miRNA分辨率差 Quantitative Real-Time PCR(实时定量PCR) 只需微量样品 非常宽的动力学范围（7 log） 高灵敏度, 高特异性

Small interference RNA SiRNA干扰技术 Small interference RNA

SiRNA技术概况 何谓 SiRNA Small interference RNA

中心法则

首先把外源的dsRNA导入细胞中， 在细胞中，该dsRNA 被Dicer切割为21～23nt的小分子干扰核糖核酸（siRNA）， 切割后的siRNA，然后结合到核糖核酸酶复合物上形成RNA诱导的基因沉默复合体（RISC）， 该复合体依赖ATP释能而解聚siRNA双链成单链以激活RISC。活化的RISC通过由siRNA决定的碱基互补配对原理切割具有同源序列的基因转录体， 转录体被降解掉，最终导致目的基因沉默效应。

思考题 细胞培养的基本条件？ 体外细胞培养方法学和细胞生长生物学？ 举一个例子，阐述上皮细胞体外培养技术和流程。 肿瘤细胞体外培养技术及临床应用。 根据你的研究方向，叙述细胞培养技术在你的研究领域中应用及注意事项。 以细胞培养技术为基础，选择一个你准备研究的细胞，设计一个药物对该细胞某个基因表达影响的方法学思路。