单基因遗传病的研究方法与技术 宋书娟 医学遗传学系细胞楼304室 电话：82802975 shujuansong@bjmu.edu.cn

已知致病基因突变分析

基因突变

基因突变 稳定突变：传递中不改变原有的突变。 动态突变：传递中不断改变自己，多见于短重复序列的突变，在一代代传递中重复次数发生明显变化。

三核苷酸重复突变

基因突变类型 点突变：只有一个或几个核苷酸的改变，是突变中最多见的形式。突变的结果分为： 同义突变、错义突变、无义突变、剪切突变等。 碱基的插入和缺失：基因编码序列中插入或丢失一个或几个碱基，其结果是突变点下游碱基序列发生移码，编码氨基酸序列都发生改变，又称移码突变（frameshift mutation），并可在突变点下游提前出现终止密码。

基因突变类型 框内突变（inframe mutation）：3个或是3的倍数的碱基缺失或插入导致的突变，使基因丢失或增加1个或几个氨基酸。 DNA大片段缺失或复制（large deletion or duplication)：几百个bp至几十个kb的碱基缺失或复制。

各种类型病理性突变的比例 无义突变和移码突变： 60％ 稀有的错义突变： 20％ DNA大片段缺失或重复: 20％ 微小突变

基因突变分析所用实验材料 临床样本取材： 外周血 组织 毛囊 颊粘膜脱落细胞 羊水细胞 绒毛 实验应用材料： DNA RNA Protein

RNA 的优点与缺点 优点: 缺点: 不包含内含子 RT-PCR 能够检测异常的剪切体 不易获得 要求操作特别小心且快速以免降解 目的基因可能不在获得的材料组织中表达 导致RNA不稳定的突变不能被检测

基因突变分析常用技术 分子杂交 聚合酶链式反应

Southern印迹杂交 探针用同位素32P标记较好

例如：脆X综合征 若X染色体在Xq27.3处呈现细丝样结构，且连接的末端形似随体，这条染色体就被称为脆性X染色体。 主要临床症状：智力低下、语言障碍、性格孤僻、伴有特殊面容——长脸、方额、大耳朵、嘴大唇厚，青春期后可见明显大于正常的睾丸。 通贯掌、三叉点C缺如。

Xq27.3

前突变和全突变 正常 CGG <6-54 前突变 CGG 55-200 全突变 CGG >200

Southern杂交法诊断Fragile X F: Fully expanded and methylated NM: Methylated X do not cut with EclXI P: Unmethylated premutation N: X in normal male and active normal female

聚合酶链式反应（PCR） Mullis F "for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method" 聚合酶链式反应于1983年由美国Cetus公司的K.Mullis建立，并和定点突变的发明者M.Smith一起荣获1993年度诺贝尔化学奖，为生命科学领域的研究开创了崭新时代。

PCR反应的特点 特异性强 引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性 灵敏度高 指数增长，从pg (10-12)可扩增至 mg (10-6)水平 简便、快速 2～4 小时完成扩增 对标本的纯度要求低 DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板

PCR反应原理和反应过程

DNA的体外复制包括3个步骤： 变性（denaturation）:94 C ~95 C 退火（annealing）:40 C ~70 C 延伸（extension）:72 C 3个步骤作为PCR的一个循环，每当完成一个循环，一个分子的模板被复制为二个，产物量以指数形式增长。

添加反应混合液 及样本 加入试管中 变性 退火 引物 耐热DNA聚合酶 d.NTPs 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ d.NTPs 5’ 3’ 引物 添加反应混合液 及样本 5’ 3’ 5’ 3’ 耐热DNA聚合酶 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 加入试管中 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 变性 5’ 3’ Most researchers are well versed in the performance of PCR. However, I usually emphasize that the performance of Real-Time PCR requires an emphasis on each step. STEPS 1) Prepare the Master Mixture and add all components to the reaction tube. 2) Denature the Template to generate single-stranded DNA. Usually performed at 95 oC for 30 to 60 s. 3) Annealing temperature. The temperature is lowered in order to promote the binding of the primers to its complimentary target. Generally ranges between 50 and 65 oC. 5’ 3’ 5’ 3’ 退火

延伸 继续延伸 循环 Taq Taq Taq Taq 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 延伸 Taq 5’ 3’ 5’ 5’ 5’ 3’ Taq 继续延伸 Taq Starts with a Picture of the Annealed Template. 4) Extension Step - Between 65 and 72 oC. In many cases, this step is linked to the annealing temperature. When done this way, it is considered a 2 step PCR. Lead into next slide It is repeated to generate an exponential growth. 5’ 3’ 5’ 5’ Taq 3’ 循环

第二个循环 4个拷贝 第三个循环 8个拷贝 第n个循环 2n个拷贝 5’ 3’ 第二个循环 4个拷贝 5’ 3’ 第三个循环 8个拷贝 This demonstrates the power of exponential growth. Start with 2 copies, then 4 copies, then 8 copies, etc. 第n个循环 2n个拷贝

PCR的反应体系和反应条件

PCR反应体系 参与PCR反应的主要成份: 模板、引物、dNTP、Taq DNA聚合酶和缓冲液等。

1. 模板 包括基因组DNA、RNA、质粒DNA、线粒体DNA等 RNA作为模板时，须先将RNA逆转录为cDNA，再以cDNA作为扩增的模板 模板量：根据反映体系调整

2. 引物(Primers) 引物决定PCR扩增产物的特异性和长度 化学合成的寡核苷酸 能与模板特异地结合 引物决定产物的特异性和长度 引物设计时必须遵循一些原则

设计引物的原则： 二条引物分别位于被扩增片段的两端，与模板正负链序列互补 长度为18 ~ 25个核苷酸 二条引物之间避免形成引物二聚体 引物的碱基组成应平衡 引物退火温度计算：Tm=2（A+T）+（C+G） 引物的5`端可被修饰（引入酶切位点、引入突变位点、生物素等标记） 在内含子上设计，不要在外显子上。G_C含量在40%左右即可。

3. 脱氧核苷三磷酸（dNTP） dATP、dCTP、dGTP和dTTP4种脱氧 核苷三磷酸的混合物 反应体系中各种核苷酸的浓度必须一致 浓度过高虽能加快反应速度，但非特异 性扩增也随之增加

4、DNA聚合酶 从一种生活在热泉（80℃~90℃）中的水栖 噬热菌中提取，有很高的耐热稳定性 Taq 酶的作用: 模板指导下，以dNTP为原料，在引物3’-OH末端加上脱氧单核苷酸，形成3’, 5’ -磷酸二酯键，使DNA链沿5’→3’方向延伸，催化DNA合成。 最适酶量：1-2.5U （酶量过多，导致非特异性扩增）

Taq DNA聚合酶复制的保真性： Taq DNA聚合酶无3’ → 5’外切酶活性，因而无校正功能，在复制新链的过程中会发生碱基错配。 Taq DNA聚合酶在每次循环中产生的移码突变率为1/30000，碱基替换率为1/8000。

5. 镁离子浓度 镁离子浓度是一个至为关键的因素，对于反应系统本身、稳定核苷酸和提高Taq 酶的活性有直接影响 当dNTP浓度为200umol/L时，MgCl2的浓度为1.5mmol/L较宜。

PCR的反应条件 反应温度（变性、退火、延伸） 反应时间（变性、退火、延伸） 循环次数（PCR效率及产物量）

1. 温度 变性温度：94 ~ 97℃ 退火温度：低于引物Tm 5℃左右 温度过高：降低扩增效率； 温度过低：增加非特异性扩增 延伸温度：72度，此时Taq酶具有较高的酶 促活性

2. 时间 第一次变性应给予足够时间（5 ~ 7分钟） 每一个步骤所需时间取决于扩增片段的长度，一般为30秒~ 1分钟，时间过长易导致非特异性扩增

3. 循环次数 重复次数一般设为25～35个循环 扩增反应的平台效应： 理论上，PCR反应产物呈指数性增长，但这种增长形式在扩增25-25个循环以后便放慢直至停止，达到反应平台，此时扩增产物量不再随循环次数的增加而呈指数增长

PCR操作中的常见问题及解决策略

试剂贮存 裂解液: 4℃贮存，避免反复冻融，否则影响裂解效果 反应液: -20℃贮存。试剂开封后，4℃保存在1-2周内用完。反应液反复冻融5次影响不大，但过多冻融会降低扩增效率。 Taq酶: -20℃贮存 反应液可以分装后再使用，避免反复冻融。

扩增失败 试剂错加或漏加 实验中如发现对照样本也扩增失败，可用原试剂重复一次，以确定试剂是否错加或漏加。 试剂失效 变性温度偏低 有些DNA所含G、C碱基对丰富，当变性温度偏低时，双链DNA不能完全解链。 退火温度偏高

拖尾 标本中DNA含量过高或杂质过多。降低加样量拖尾可明显改善。 Taq酶加量过大或扩增循环数太多

非特异条带 退火温度低,提高退火温度。 引物特异性不佳，切胶纯化特异条带 Taq酶加量过大或扩增循环数太多

引物二聚体 引物量过多：降低引物浓度。 引物设计问题 操作问题：反应体系建立后，如在室温放置时间过长，会引起扩增后的二聚体加重。 注意加物顺序，最后加酶

应用PCR相关技术进行基因突变分析的策略与方法

策略与方法 直接分析法： PCR片段大小分析：片段大小有明显差异 PCR-RFLP：有酶切位点 PCR-测序：确定突变点碱基改变 多重连接探针扩增（MLPA）：片段缺失与重复 RT-PCR: 基因大，可取到新鲜材料，且基因在其中有表达 间接分析法： PCR-STR连锁分析：基因大；在已知致病基因编码区未检测到突变的家系

1. 脊髓小脑性共济失调 脊髓小脑性共济失调是遗传性共济失调的主要类型，包括SCA1－27。成年期发病、常染色体显性遗传及共济失调等是本病的共同特征，并表现在连续数代中发病年龄提前和病情加重（遗传早现）。 SCA3是我国最常见的脊髓小脑性共济失调亚型，基因位于14q24..3－32，含4个外显子。CAG突变位于4号外显子，患者扩增拷贝数为61－89，正常人为12－41。

应用PCR技术分析一遗传性脊髓小脑性共济失调（SCA)3型家系 NC:正常对照 PC:阳性对照 F:家系成员 M:Marker 结果： 家系成员1、3、4有SCA3致病基因突变; 家系成员2、5未检测到突变 1 3 5 2 4 NC F1 F2 F3 F4 F5 PC M

2. 脊肌萎缩症 　 脊肌萎缩症( Spinal Muscular Atrophy , SMA)系指一类由于下运动神经元变性导致的进行性骨骼肌无力和萎缩的一组疾病 ,是儿童和少年常见的致死性常染色体隐性遗传病之一 ,其隐性致病基因携带率在人群中为 1/ 40～1/ 50 ,发病率为1/6000～1/10000.

应用PCR-RFLP技术分析脊肌萎缩症（SMA） 致病基因SMN PCR扩增SMN基因exon7,DraI酶切PCR产物. 酶切N：正常人PCR产物被酶切为两条带 酶切P：阳性对照PCR产物被酶切为一条短带 病人1：结果显示SMN基因有突变 病人2和3：结果显示未有突变

3. 腓骨肌萎缩症(CMT) CMT是一类周围神经系统遗传病 ,其遗传方式可为常染色体显性遗传(AD ,占绝大多数) 、常染色体隐性遗传(AR)及 X连锁显性遗传(XD) 依据病理和电生理特点分为两型:脱髓鞘型 (CMT1 型) 和轴突型 (CMT2型). CMT1型约占 CMT总数的70%，70%以上CMT1由PMP22基因重复引起 其中X连锁显性遗传CMT致病基因为CX32，含有2个外显子

MLPA分析PMP22基因重复突变

PCR-测序直接分析CX32基因来诊断X连锁腓骨肌萎缩症

4. 假肥大型肌营养不良症 假肥大型肌营养不良 (DMD) 是一种高发病率、高致残、高致死的X染色体连锁的遗传性疾病，在2500个活产男婴中即有一个患者 致病基因DMD含有79个外显子 DMD的最主要遗传缺陷是外显子缺失，约占60%-70%

多重PCR法原理 引物 1 2 3 多重PCR仅判断有或无，而不能定量测定 4 4 3 2 电泳 1

MLPA 技术简介 MLPA Multiplex ligation-dependent probe amplification 链接依赖型多探针扩增技术 最早由荷兰人Schouten JP (Schouten JP et al, 2002) 在原有PCR技术上发展出来 既能判断有无，还能测定量

MLPA 技术原理

MLPA方法检测DMD 1 2 3 4 5

甲基化-MLPA 技术检测突变

新致病基因的研究方法和技术

连锁分析与二代测序相结合加快新基因的发现 研究对象不同，策略方法不同 家系连锁分析来定位: 适于分析较大的遗传病家系，不适于散发病例和小家系病例 二代测序技术： 适于散发病例和小家系病例 连锁分析与二代测序相结合加快新基因的发现

定位克隆 Met Val Ser Leu Gln Pro A T G C A T G C Met Val Ser Leu Stop

候选克隆 定位候选克隆 GDB或GenBank 已知的基因或EST 与疾病关系 确定致病基因

连锁分析 利用被定位的基因与在同一染色体上另一遗传座位相连锁的特点，将该基因定位在某一染色体或染色体某一区带上。

常见遗传标记 DNA STR SNP

PCR-STR连锁分析 Primer 1 CA CA CA Primer 2 CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA

毛细管电泳分析PCR片段大小

分析 D4S1534 D4S2929 D4S2460 D4S423 I-1 114,124 176,178 200,202 105,112 II-1 114,120 153,159 107,109 II-2 157,176 202,204 II-3 114,122 157,178 102,105 II-4 II-5 198,202 III-1 153,176 109,112 III-2 176,176 202,202

连锁分析结果

通过全基因组扫描来定位基因 均匀分布于23对染色体上的STR SNP芯片

二代测序技术来找候选突变基因 外显子组测序

基因功能相关分子遗传学研究方法

隐性突变和显性突变的致病机制 —— 隐性突变往往导致失去功能（loss of function） —— 显性突变可导致获得功能（gain of function）和失去功能 失去功能：单倍剂量不足（halpoinsufficency） 获得功能：显性负效应（dominant negtive）

基因突变对基因功能的影响及发病机制研究 将目的基因cDNA克隆到合适载体 应用定点突变方法建立突变基因载体 体外功能研究：应用分子生物学技术研究与正常基因相比突变基因突变有否功能差异。 细胞水平功能研究，突变基因转然细胞内，顺时转染或建立细胞系，研究其所引起细胞功能改变及其可能信号转导通路。

将目的DN片段克隆到质粒载体

建立遗传病动物模型 隐性遗传病： 往往因基因失去功能所致，适于建立基因敲除动物模型，纯合突变会表现出人类疾病相似表型 显性遗传病： 失去功能引起单倍剂量不足，适于建立基因敲除动物模型，杂合突变动物会表现出人类疾病相似表型，纯合突变往往致死。 获得功能导致显性负效应，适于建立转基因动物模型，杂合突变会表现出人类疾病相似表型，纯合突变往往表型更重。

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