表观遗传学创新实验 5’-氮胞苷处理水稻幼苗对基因组 DNA甲基化的影响 东北师范大学生物基础实验教学中心 庞劲松 刘宝

表观遗传学与DNA甲基化 DNA甲基化作用 DNA胞嘧啶甲基化检测 5’氮胞苷处理对水稻DNA甲基化的影响 DNA的甲基化及其方式 检测方法：MSAP，bisulfite sequencing 5’氮胞苷处理对水稻DNA甲基化的影响 实验目的 实验材料 仪器 试剂 实验方法 5’-氮胞苷处理水稻幼苗 植物基因组DNA的提取与纯化 基因组DNA酶切-连接接头 PCR扩增：预扩增，选择性扩增 PAGE电泳 预期实验结果 注意事项与建议 思考题 参考文献

表观遗传学： 表观遗传变异包括: X－染色体失活、转基因沉默、核仁显性和基因组印记等方面。 不需要基因序列改变而产生的可遗传的基因表达改变；主要包括DNA的甲基化修饰和组蛋白氨基酸的末端修饰。 表观遗传变异包括: X－染色体失活、转基因沉默、核仁显性和基因组印记等方面。 表观遗传变异的原因：是由于表观遗传密码的改变，如DNA甲基化、组蛋白的公家修饰改变等。 DNA甲基化： 在DNA 复制后，经DNA甲基转移酶（DMT）催化，将S-腺苷酰-L-甲硫氨酸(SAM)上的甲基基团连接到DNA 分子腺嘌呤碱基或胞嘧啶碱基上，进行DNA修饰的过程。

DNA甲基化作用 DNA甲基化的方式 胞嘧啶甲基化 腺嘌呤甲基化 在DMT(DNA甲基转移酶）的作用下，CpG（CNG,CCGG）位点胞嘧啶C5被甲基化 图1 胞嘧啶甲基化过程 DAM (DNA腺嘌呤甲基转移酶) 识别回文序列GATC, 在此位置两条链的腺嘌呤N-6位置上同时甲基化，同时SAM转变为SAH(S-腺苷高半胱氨酸) 图2 腺嘌呤甲基化过程

DNA甲基化的生物学意义 影响基因表达状态：通过该表基因调控区DNA甲基化程度调控基因转录 图3 甲基化与基因沉默 参与基因组防御：通过高度甲基化而使外源DNA（如转座子）处于沉默状态 提高环境适应能力：在不改变基因型的情况下产生可遗传的新表型

DNA胞嘧啶甲基化的种类和形成 从头甲基化 (de novo methylation) DNMT3a，DNMT3b 在完全没有甲基化的DNA上加上甲基。 维持甲基化 (maintenance methylation) Met1，DNMT1 较特异地识别半甲基化状态的DNA，负责 在细胞分裂过程中依据DNA母链的甲基化 状态给新合成的DNA链上加上甲基。 图4 两种胞嘧啶甲基化方式

DNA胞嘧啶甲基化检测方法 使用对胞嘧啶5’-甲基化状态敏感的限制性内切酶进行酶切处理，然后检测多态性： 甲基化敏感扩增多态性 (MSAP, Methylation Sensitive Amplification Polymorphism) 胞嘧啶转化为其它碱基，然后对比测序： 重亚硫酸盐测序 (Bisulfite sequencing) GCmTACT 重亚硫酸钠 GCmTATT 测序 测序 此外，还有单核苷酸法，甲基化接受力的检测法，CpG岛分离法和基因活性测量法，基因芯片法等

MSAP 用途： 原理： 甲基化状态分析： 原始序列 内切酶 CCGG CCmGG CmCGG Hpa II CC GG 不切割 Msp I 最常用的大规模检测基因组甲基化变异水平和位点的手段 原理： 利用对DNA甲基化敏感性不同的同裂酶分别切割DNA，产生不同的酶切产物，同时将酶切产物添加接头，然后进行PCR扩增、PAGE电泳、银染，产生可见的具有不同酶切型式的谱带，即可得知DNA甲基化信息。 甲基化状态分析： 在不同泳道相对应的位置上，如果Msp I酶切产物有扩增带、而Hpa II酶切产物没有扩增带的，说明此处的序列是CCmGG；若都有扩增带，说明此处是CCGG。还可以进一步对差异条带进行切胶回收、克隆、测序，以便得知发生甲基化变化的胞嘧啶的具体位置。 表1 甲基化敏感酶对不同甲基化状态DNA的切割结果 原始序列 内切酶 CCGG CCmGG CmCGG Hpa II CC GG 不切割 Msp I CCm GG

MSAP流程： 提取基因组DNA （注意发育时期和成长状态相同） ………ATCCGGTGGCTTGCCmGGAC…… ………TAGGCCACCGAACGG CCTG…… Msp I 酶切+接头 Hap II酶切+接头 ATCC GGTGGCTTGCCm GGAC ATCC GGTGGCTTGCCmGGAC TAGG CCACCGAACGG CCTG TAGG CCACCGAACGG CCTG PCR PCR PAGE电泳 PAGE电泳 Msp I 5’ …CC(m)G G… 3’ 3’ …GG C(m)C… 5’ Hpa II 5’ …CCGG… 3’ 3’ …GGCC… 3’

重亚硫酸盐测序 图5 重亚硫酸盐测序原理

5’氮胞苷处理对水稻DNA甲基化的影响 实验目的 实验材料 使用不同浓度的5’氮胞苷溶液，处理生长早期的水稻幼苗，使其基因组DNA胞嘧啶甲基化水平发生显著的可遗传改变，使用MSAP方法检测DNA胞嘧啶甲基化水平的改变；水稻幼苗因DNA甲基化水平改变而影响基因表达水平，产生明显的表观遗传表型。 实验材料 水稻：日本晴 (Oryza sativa var japonica, nipponbare) 5’氮胞苷如何影响基因组DNA甲基化水平： 5’氮胞苷可以与DNA甲基转移酶（DMT）结合从而抑制其活性，在DNA复制过程中抑制维持甲基化作用，使复制后的DNA甲基化水平降低。

所需仪器 离心机 PCR仪 气浴摇床 水浴摇床 植物生长箱 电泳仪 电泳槽 微量移液器 紫外分析仪 分析天平 图6 所需主要仪器

试剂 植物基因组DNA改良CTAB提取液： PCR试剂：Takara rTaq，10X PCR buffer，ddH2O， buffer A: 0.35mol/L Sorbitol，0.1mol/L Tris-HCl pH7.5，0.5mmol/L EDTA; buffer B: 0.2mol/L Tris-HCl pH7.5，0.05mol/L EDTA，2mol/L NaCl，2%CTAB; buffer C: 5%N-lauroylsarcosine PCR试剂：Takara rTaq，10X PCR buffer，ddH2O， PCR引物 预扩增引物： H/M+0: (5´-GACTGCGTACCAATTCA-3´) EcoRI+0: (5´-ATCATGAGTCCTGCTCGG-3´) 选择性扩增引物： H/M+AN: 5´-GACTGCGTACCAATTCAA(T, C, G)-3´ EcoRI+AN: 5´-ATCATGAGTCCTGCTCGGA(T, C, G)-3´。 酶切-连接试剂：EcoRI (NEB)，Hap II (NEB)，Msp I (NEB)，T4 DNA ligase，T4 10 x reaction buffer 接头：EcoRI adapter: 5’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’ CATCTGACGCATGGTTAA HapII/MspI adapter: 5-‘GATCATGAGTCCTGCT-3’ AGTACTCAGGACGAGC PAGE试剂：聚丙烯酰胺，尿素，AgNO3，Na2CO3，溴酚蓝， 银染固定/终止液 (10%冰乙酸)，染色液 (2升双蒸水预冷，用时加2克硝酸银，3ml 37%甲醛)，显影液 (2升双蒸水中溶解60克碳酸钠，冷却至10-12ºC ，用时，加入3ml 37%甲醛，400ul硫代硫酸钠（10mg/ml）)。 其它试剂：5’-氮胞苷(100mg/mL)，蒸馏水，PVP (20%)，氯仿:异戊醇(24:1)，异丙醇，70%乙醇，RNA酶A (DNase-free)，TE，TAE，琼脂糖，EB，未酶切的λ DNA， 1xTBE (0.089M Tris-borate, 0.089 M Boric Acid, 0.002 M EDTA) ， 3x loading buffer (300 mM NaOH, 97% formamide, 0.2% bromophenol blue)。

实验方法 5’-氮胞苷处理水稻幼苗：26℃，暗培养 (1) 取水稻Nipponbare种子10粒X 4组，分别置于90mm培养皿内的双层滤纸上，加入15mL蒸馏水浸种24h；（第一天） (2) 分为三个实验组和一个对照组，实验组分别用25mg/mL, 50mg/mL, 100mg/mL5’-氮胞苷溶液处理，对照组用蒸馏水培养，共处理10天，每天换处理液1次；（第二~十一天） 图7 5’-氮胞苷处理的水稻幼苗（右）和对照植株（左）

植物基因组DNA的提取与纯化 改良CTAB法(Kidwell and Osborn, 1992) 不同处理的叶片1g 液氮中研磨成粉 转入50ml离心管 加入等体积DNA提取缓冲液(A:B:C=1:1:0.4混合，加1%PVP于B液) 65℃恒温水浴摇床，40-50rpm振摇90分钟 加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，轻轻上下颠倒10-15分钟 4℃3000rpm离心10-15分钟 上层水相 加入2/3体积的预冷异丙醇，上下颠倒5分钟并置4℃冰箱内10min DNA沉淀后于4℃3000rpm离心收集DNA于管底 DNA于70%乙醇中过夜。 DNA沉淀 （第十二天）

Genomic DNA DNA沉淀 Genomic DNA溶液 风干DNA 2ml Eppendorf中加1ml TE溶解沉淀 待DNA完全溶解后，加入5μl不含DNA酶的RNA酶，37℃保温30 分钟以除去DNA中的RNA。 加入等量氯仿:异戊醇(24:1) 纯化DNA，轻轻上下颠倒10-15分钟 4℃3000rpm离心10-15分钟 DNA沉淀 70%乙醇过夜洗涤DNA 溶于DNA于200-500μl TE中 Genomic DNA溶液 0.8%琼脂糖凝胶电泳，检查DNA的质量并据已知的DNA Marker （未酶切的λDNA）估计其浓度。 调整DNA浓度，置於-20℃备用。

基因组DNA酶切-连接接头 甲基化分析采用两种甲基化敏感酶HapⅡ和MspⅠ（NEB）。在限制性酶切和连接前，先把两个单链的接头复性为双链结构(序列见试剂部分)，即100℃变性5分钟, 缓慢冷却至室温，-20℃冷冻保存备用。 水稻MSAP限制性酶切和连接体系如下： 表2 水稻MSAP限制性酶切、连接体系 T4 10 x buffer 2.5μl BSA (10mg/L) 0.1μl EcoR I adaptor (5pM) 0.5μl H/M adaptor (50pM) EcoR I (20U/μl) H/M HpaII (20U/μl) 0.25μl MspI (10U/μl) 0.5μl T4 ligase Genomic DNA 300ng AFLP-Water 补足总反应体积20μl 混匀体系，37℃，6小时，8℃，4小时，4℃保存。 共四个处理组，即Nipponbare 25mg/mL处理组，Nipponbare 50mg/mL处理组，Nipponbare 100mg/mL处理组，Nipponbare对照组；每组分别用HapII/MspI酶切，共需切8管 （第十五天）

PCR扩增 预扩增：水稻AFLP预扩增体系如右表(预扩增引物PCR引物部分)： 混匀体系，按下列参数进行PCR扩增反应： PCR程序：94℃ 预变性2min, 94℃变性30秒，56℃复性30秒，72℃延伸60秒, 共进行30个循环，最后72℃延伸10分钟。 根据检测结果，用0.1x TE buffer稀释预扩增产物1/10~1/40，作为PCR选择性扩增的DNA模板。 表3 AFLP预扩PCR体系 10 x PCR reaction buffer 2.5μL dNTPs (2.5mM) 2μL EcoR I adaptor + A (5μM) 1μL H/M adaptor +0 (5μM) Taq DNA polymerase (5U/μL) 0.2μL PCR water 16.3μL DNA 模板（酶切连接产物） Total volume 25μL

水稻AFLP选择性扩增体系如下： 按以下参数进行PCR扩增反应： 94℃ 预变性2分钟, 94℃变性30秒，65℃复性30秒，72℃延伸80秒，以后每轮循环温度递减1℃，扩增10轮。接着94℃变性30秒，  55℃复性30秒，  72℃延伸80秒，共进行40个循环，最后72℃延伸10分钟。 （第十七天） 表4 AFLP选扩PCR体系 10 x PCR reaction buffer 1.5μL dNTPs (2.5mM) 0.6μL EcoR I primer (5μM) H/M primer (5μM) Taq DNA polymerase (5U/μL) 0.12μL PCR water 9.58μL DNA 模板（预扩增稀释产物） 2μL Total volume 15μL

PAGE电泳 电泳装置图 玻璃板分为大板和小板(上部凹形) 。 自来水清洗 95％酒精擦两遍 硅化：均匀擦涂亲和硅化试剂于大板的一面，剥离硅化试剂于小板的一面 5分钟后，95％酒精再擦两遍， 装板 灌胶 图8 PAGE电泳系统

尿素-PAGE胶配制 灌胶前，加入四甲基乙二胺（TEMED）30μL，10%过硫酸铵（APS）160μl，混匀，立即灌胶。灌胶时玻璃板倾斜15度。胶聚合1小时以上才可以电泳。 电泳：电泳仪采用北京市六一仪器厂DYY-10C型。电泳装置使用北京君意东方电泳设备有限司测序装置新JY-CX2B型。电泳缓冲液为1xTBE ，85W预电泳1小时，胶板的温度达到55˚C。点样前，DNA样品95˚C变性5分钟，立即冰浴，加3x loading buffer, 混匀，瞬时离心，点样量16μL， 恒功率55W电泳到指定位置，即可卸板染色。 表5 PAGE胶配方 尿素(分析纯) 16.8g 10xTBE 4mL 40%丙烯酰胺胶贮液(Acrylamide/Bis 19:1) 16mL 超纯水 加到总体积40mL 灌胶图 电泳图

银染操作 电泳结束后，轻轻分离两块玻璃板，将 附着胶的大板置于固定/终止液中，轻摇 20分钟，直至指示染料消失。 凝胶洗涤，回收固定/终止液，用双蒸水 洗涤凝胶3次，每次至少2分钟，凝胶板 从水中取出后，竖起空水15秒。 染色，将胶板移至染色液中，轻摇30分钟。 凝胶显影，将染色后的胶板放入双蒸水中5-10秒，迅速取出并竖起控水，随后把胶板放入预冷的一半显影液中，充分摇动，当出现第一批条带后，倒入另一半显影液，轻摇至条带全部出现。（注意：从放入水中到放入显影液中，时间不应超过10秒。） 终止显影，在显影液中直接添加等体积的固定/终止液（第一步中用过的），停止显影并固定影像。 固定完全后，即醋酸和碳酸钠反应完全(溶液不再有二氧化碳产生)，用双蒸水洗涤凝胶2次，每次至少2分钟，凝胶板从水中取出后，竖起控水凉干备用。 （第十九天） 图9 PAGE胶银染

预期实验结果 同一位置处不同样品电泳条带的不同，显示此处胞嘧啶甲基化状态不同。 （第二十天） 图10 预期结果PAGE电泳图

注意事项与建议 五氮胞苷（5-azacytidine；MW:244.21）：粉末于-20℃保存，见光或遇热分解，使用时配母液于4℃保存，保存时间不宜超过半个月； 丙烯酰胺为剧毒试剂，配制、使用时必须按有关规程做好个人防护；

思考题 5’-氮胞苷为什么能使DNA甲基化水平降低？ MSAP的原理是什么？ 如何分析MSAP电泳图？

参考文献 [1] Razin A, Cedar H. DNA methylation-Biochemistry and Biological Significance. J Chromatogr, 1992, 581(1): 31-40. [2] Flavell R B. Inactivation of gene expression in plants as a on sequence of specific sequence duplication. Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 91:3490-3496. [3] Ng H.H, Bird A. DNA methylation and chromatin modification. Curr Opin Genet Dev, 1999, 9(2): 158－163 [4] Stokes T. Methylation of a different kind. Trends Plant Sci, 2001, 6(11):503-512.