安徽建筑工业学院 环境与能源工程学院 鲍立宁 洪桂云 环境工程微生物学实验 安徽建筑工业学院 环境与能源工程学院 鲍立宁 洪桂云

实验一 显微镜的使用及微生物形态的观察 实验目的 1．学习普通光学显微镜的使用方法（本实验学习低倍镜和高倍镜的使用）。 实验一 显微镜的使用及微生物形态的观察 实验目的 1．学习普通光学显微镜的使用方法（本实验学习低倍镜和高倍镜的使用）。 2．结合生物滤池生物膜及曝气池活性污泥的观察，认识原生动物、菌胶团等微生物的形态，并学习测量微生物大小的方法。

实验原理 由于细菌的细胞小，菌体透明，肉眼无法看到的微小生命体。我们可以借助显微镜来进行观察。显微镜的种类很多，但基本构造可分为两大部分：一是机械装置，二是光学系统。细菌的简单染色就是根据细菌对不同染料的亲和力不同，采用单一的一种染料，对细菌的涂片进行染色的方法，从而能借助显微镜更清楚的观察到其形态结构。

显微镜的使用 1．观察前的准备 (1) 置显微镜于平稳的实验台上，镜座距实验台边沿约3-4cm, 镜检者姿势要端正，左眼观察，右眼便于绘图或记录。 (2) 调节光源、光线较强的天然光源宜用平面镜；光线较弱的天然光源或人工光源宜用凹面镜。

2．低倍镜观察 （1）低倍镜旋到镜筒下方，旋转粗调节器,镜头与载物台相距0.5cm。 （2）打开聚光器，使之与载物台同样高度。 （3）左眼看目镜，观察光源强弱，使全视野内均匀明亮。可通过扩大或缩小光圈、升降聚光器，旋转反光镜调节光线。

3．高倍镜观察 （1）将高倍镜转至正下方，在转换物镜时，需用眼睛在侧面观察，避免镜头与玻片相撞。 （2）如果低倍镜重调对，换高倍镜时基本可以看到目的物，若有点模糊，用细调节器调就清晰可见。 （3）找到最适宜观察的部位后，将此部位移至视野中心，准备用油镜观察。

观察结果 观察所制备的微生物标本玻片，画出所见原生动物、细菌、真菌等微生物的形态草图。

实验二 活性污泥中原生及微型后生动物观察和数量的测定 实验目的 测定活性污泥法曝气池混合液中微型动物的数目。

实验原理 测定微生物数量方法很多，通常采用的有显微镜直接计数法、平板计数法和光电比浊计数法。 显微镜直接计数法 将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上，又称微型动物计数板，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。

微型动物计数板的构造

微型动物计数板制作方法： 采用厚质玻璃割成9cm长，4cm宽的长方块，玻璃厚度以0.3一0.4cm为宜。利用氢氟酸腐蚀法，使玻板中央刻上10×l0＝100个小方格，小方格的大小没有严格规定，只要一片大号盖玻片能盖满格子有余和便于在显微镜下计数就可以了。用大号盖玻片切成宽约0.7cm的玻条，用阿拉伯树胶粘在计数用的小方格的四周，使呈一圈凸起的边框。这样，就制成了一块微型动物计数板，如图8—5所示。 关于氢氟酸腐蚀法划方格的方法是先将玻璃表面涂一层薄面均匀的石蜡，然后用尖针在石蜡层上刻出所要求的方格，再以氢氟酸蒸汽进行重蒸。

实验器材 显微镜、计数板、活性污泥 、盖玻片、吸管、吸水纸。

计数方法 1．将活性污泥法曝气池混合液轻轻搅拌均匀； 2．取洗净的滴管一支，吸取摇匀的混合液或己稀释的混合液加一滴到计数板的中央方格内，然后加上一块洁净的大号盖玻片，使玻片的四周正好搁在计数板四周凸起的边框上。 3．用低倍显微镜进行计数，同时记录各种动物的活动能力、形态结构等。原生动物中有不少种类是群体，须将群体和群体上的个体分别计数。 4．计算：设在一滴水中测得钟虫30只，则每ml混合液中含有钟虫30×2×20＝1200只，如测得轮虫10只，则每毫升混合液含轮虫10×2×20＝400只

结果记录 动物名称 每滴稀释液中的虫数 每ml混合液中的虫数 状态描述

实验三 培养基的配制和灭菌 实验目的 1.熟悉玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备。 2.掌握培养基和无菌水的制备方法。 3.掌握高压蒸气灭菌技术。

实验原理 培养基是用人工的办法将多种营养物质按微生物生长代谢的需要配制成的一种营养基质。培养基中均应含有满足微生物生长发育且比例合适的水分、碳源、氮源、无机盐、生长因素以及某些特需的微量元素外还应具有适宜的酸碱度〔pH值〕、缓冲能力、氧化还原电位和渗透压。

实验器材 (1)药品和试剂：牛肉膏、蛋白陈、NaCl、10％NaOH溶液、l0％盐酸溶液、琼脂、水等。 (2)器材：小烧杯、小铝锅、天平、牛角匙、1000mL刻度烧杯、玻棒、pH试纸、试管、分装漏斗、棉花。高压蒸气灭菌锅、烘箱。

实验步骤 一、玻璃器皿的洗涤和包装 清洗并烘干玻璃器皿：如培养皿、移液管、试管等。 棉塞的制作 包装培养皿和移液管等。 3-1棉塞制作方法 棉塞的制作 包装培养皿和移液管等。 3-1棉塞制作方法 3-2移液管灭菌前的包装

二、培养基的配制 牛肉膏蛋白胨培养基的配制 （一）培养基配方： 牛肉膏2.5g 蛋白胨5.0g、NaCl2.5g、琼脂10.0g、自来水500mL、pH7.2-7.4。 （二）操作步骤： 1. 取一个1000mL烧杯，装500mL蒸馏水。 2. 按配方逐一正确称取各种成分，依次加入水中溶解。 注意：a. 前一种成分溶解之后，才能加入下一种成分 b. 蛋白胨、肉膏可加热促进溶解 c. 加热过程应不断搅拌，以免糊底烧焦，并适当补充因蒸发而损失的水量。

3. 调pH值：用10％ NaOH调pH至7.2~7.4，用精密pH试纸对照。 4. 分装：将培养基分装于5支试管，其余全部倒入250mL锥形瓶中，分别塞上棉塞。 5. 包扎成捆，挂上标签，注明何种培养基。 6. 灭菌备用：灭菌条件：121 ℃ （相当蒸汽压力0.103MPa）培养基灭菌后必须在37℃下恒温培养24h，确定无菌生长，方可使用。

图 例 图2－3培养基分装 图2－4 斜面制作

三、稀释水的制备 1.取一个250mL的锥形瓶装90(或99)mL蒸馏水，塞棉塞、包扎，待灭菌。 2.另取5支18mm×180mm的试管，分别装9mL蒸馏水，塞棉塞、包扎，待灭菌。 无菌稀释水为微生物分离实验中所需要的材料。

四、灭菌 加热灭菌有干热灭菌和湿热灭菌。 干热灭菌法：电热烘箱作为干热灭菌器 干热灭菌的操作方法 a. 将待灭菌的物品放入恒温箱，将温度调节至160℃并维持2h； b. 把恒温箱的调节旋钮调回零处，待温度降到50℃左右，才能将物品取出。

湿热灭菌：高压蒸气灭菌法 高压蒸气灭菌法的操作步骤如下： 1. 灭菌锅内加入一定量的水。 2. 将待灭菌的物品放入锅内，并关严锅盖。 高压蒸气灭菌法的操作步骤如下： 1. 灭菌锅内加入一定量的水。 2. 将待灭菌的物品放入锅内，并关严锅盖。 注意：器物不能装得太满。 3. 接通电源，进行加热。 4. 排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待温度计指示温度为100℃时关闭排气阀；或当排出的蒸气相当猛烈且微带蓝色时关闭排气阀。

5. 当压力达1.05kg/cm2(灭菌器内的温度为121℃)即开始灭菌，使其维持15～30min。对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物质时，应适当降低压力(0.56kg/cm2) ，延长时间。 6. 灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时，才能打开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品，排出锅内剩余水。 7. 待培养基冷却后置于37℃恒温箱内培养24h，若无菌生长则放入冰箱或阴凉处保存备用。

思考题 1.配制培养基有哪几个步骤?在操作过程中应注意些什么问题?为什么? 2.培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌?若不能及时灭菌应如何处理？已灭菌的培养基进行无菌检查？ 3.高压蒸汽灭菌中为什么要把冷空气排净，为什么在灭菌后不能骤然快速降压，并要再放尽锅内蒸汽才能打开锅盖?

实验四 用比浊法测定大肠杆菌的生长曲线 实验目的 了解细菌生长曲线的特点及测定原理，学会用比浊法测定细菌的生长曲线。

实验原理 将一定数量的细菌，接种于适宜的液体培养基中，在适温下培养，定时取样测数，以菌数的对数为纵坐标，生长时间为横坐标，作出的曲线称为生长曲线。 比浊法是根据细菌悬液细胞数与混浊度成正比，与透光度成反比关系，利用光电比色计测定细胞悬液的光密度(即OD值)，用于表示该菌在本实验条件下的相对生长量。

实验器材 (1)活材料：培养18h的大肠杆菌（E. coli）培养液。 (2)培养基和试剂：牛肉膏蛋白胨液体培养基14支(每支10ml)，浓缩5倍的牛肉膏蛋白胨培养基。无菌酸溶液(甲酸：乙酸：乳酸=3：1：1)。 (3)器材：1ml无菌吸管、摇床、冰箱、光电比色计、标签等。

实验方法 1、接种：按无菌操作法用吸管向每管准确加入0.2 ml的大肠杆菌培养液。 2、培养：将接种后的培养管置于摇床上，在37℃下振荡培养。其中9支培养管分别于培养的0、1.5、3、5、7、9、12、24和36h后取出，放冰箱中贮存，待测定。 3、比浊：以未接种的牛肉膏蛋白胨液体培养基调零点，在光电比色计上，选用520～560nm波长进行比浊，从最稀浓度的菌悬液开始，依次测定。

实验作业 绘制曲线：以细菌悬液的光密度值(OD)为纵坐标，培养时间为横坐标，绘出大肠杆菌在正常生长、加酸处理和加富培养三种条件下的生长曲线。

实验五 细菌淀粉酶和过氧化氢酶的定性测定 实验目的 通过对淀粉酶和过氧化氢酶的定性测定加深对酶和酶的作用的感性认识。

仪器和材料 1．试管(15×150毫米)4支、试管架1个、培养皿(90毫米)3套、接种环。 2．肉膏胨淀粉琼脂培养基l瓶(约50毫升)。 3．革兰氏碘液1小瓶(滴瓶)、3％～10％过氧化氢1小瓶(滴瓶)。 4．枯草杆菌和大肠杆菌斜面各一支。

实验内容和操作方法 (一)细菌淀粉酶在固体培养基中的扩散实验 1．将肉膏胨淀粉琼脂培养基加热融化,待冷至45℃左右倒入无菌培养皿内，共倒3个，静置待冷凝即成平板。 2．在无菌操作条件下，用接种环分别挑取枯草杆菌、大肠杆菌和活性污泥各一环分别在3个平板上点种5个点。倒置于37℃恒温箱内培养24～48h。 3．观察结果，取出平板，分别在3个平板内菌落周围滴加碘液，观察菌落周围颜色的变化。若在菌落周围有一个无色的透明圈，说明该细菌产生淀粉酶并扩散到基质中去。若菌落周围仍为蓝色，说明该细菌不产生淀粉酶。

（二)过氧化氢酶的定性测定 1．将配制的斜面培养的枯草杆菌和大肠杆菌各1支放在试管架上。 2．用滴管吸取过氧化氢滴加入两管菌种斜面上，有气泡产生的为接触酶阳性(有过氧化氢酶)，无气泡产生的为接触酶阴性(无过氧化氢酶)。 3．分析结果，把所观察到的现象记录下来，进行分析。

实验作业： 记录实验结果，并进行分析。

实验六 空气中微生物的测定

实验目的 了解不同环境条件下，空气中微生物的分布状况； 学习并掌握检测和计数空气微生物的基本方法。

实验器材 灭菌培养皿、天平、称量纸、恒温箱、培养基

(—) 肉汤蛋白胨琼脂培养基（培养细菌） 牛肉膏 5.0g 蛋白胨 10.0g、 NaCl 5.0g、 琼脂 20.0g、 自来水 1000mL、 pH 7.2~7.4 灭菌条件:0.103Mpa（1210C、15~20min）

（二）查氏培养基（培养霉菌） 蔗糖 30g K2HPO4 1g KCl 0.5g NaNO4 2g MgSO4·7H2O 0.5g FeSO4·7H2O 0.01g 水 1000mL pH 自然 灭菌条件：0.072Mpa（1150C，15~20min）

实验步骤 落菌法 (1)将肉汤蛋白胨琼脂培养基、查氏琼脂培养基溶化后，各倒五个平板，冷凝。 （2）在一定面积的空间内，选择5点，每种培养基每个点放一个平板，打开皿盖，暴露于空气中10分钟后盖上盖子。 （3）肉膏蛋白胨平板于37℃，倒置培养1天；查氏琼脂平板倒置于28℃培养分别培养24~48h各自计算其菌落数，观察菌落形态、颜色。

X X X 测定空气微生物的5点采样法

奥梅梁斯基曾建议：面积为100cm2的平板培养基，暴露在空气中5分钟相当于10升空气中的细菌数。 奥氏公式： 5 t 100 A 1000 10 × N × C = 式中：C—空气细菌数； A——捕集面积，cm2 ； t ——暴露时间，min； N——菌落数，个。

实验作业 记录观察到的结果，把它填入下面表格中，分析不同环境中微生物的种类和数量存在差异的原因。

实验七 水中细菌总数的检测 实验目的 1．学习并掌握饮用水质和水源水质的细菌学检测方法。 2．了解细菌总数与水质的关系。

实验原理 所谓细菌总数（简写为CFU）是指将1ml水样放在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基中，于37℃培养24h后，所长出的细菌菌落总数。细菌总数越多，表示水体受有机物或粪便污染越严重，携带病原菌的可能性也越大。

实验器材 1．培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。 2．仪器：电炉、恒温水浴锅．恒温培养箱．放大镜。 3．试剂：硫代硫酸钠溶液。 4．其他用品：无菌采样瓶，9ml无菌水试管，无菌培养皿(直径9cm)，无菌移液管等。

实验步骤 1．水样采取 2．细菌总数测定 (1) 水样稀释：根据水样受有机物或粪便污染的程度，可用无菌移液管作10倍系列稀释，获得l:10，1:100，1:1000等系列稀释液。 (2) 混菌法接种；按照无菌操作的要求，用无菌移液管吸取3个适宜浓度的稀释液1ml（或0.5ml），注入无菌培养皿中，倾注15ml融化并冷却到45℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。 (3) 培养：待琼脂培养基凝固后，翻转培养皿，底面向上，置于37℃恒温培养箱内培养24h。 (4) 计算每个稀释度的平均菌落数： (5) 计算细菌总数 (6) 报告方式见教材P423说明。

实验作业 将实验中结果填入下表。

本方法适用于生活饮用水和低浊度的水源水中总大肠菌群数的测定。 实验八 水中总大肠菌群的测定 本方法适用于生活饮用水和低浊度的水源水中总大肠菌群数的测定。

实验目的 1.了解总大肠菌群的数量指标在环境领域的 重要性，掌握总大肠菌群的检验方法。 2.通过检验过程，了解大肠菌群的生化特性。

实验原理 一些大肠菌群细菌能在44℃下生长并发酵乳糖产酸产气，由于它们主要来自粪便，因此将它们称为粪大肠菌群。大肠菌群已成为国际上公认的粪便污染指标。 根据我国生活饮用水标准检验法(GB5750—85)，总大肠菌群数可用多管发酵法或滤膜法检验，本实验采用多管发酵法(MPN法)。

实验器材 1．水样：受粪便污染的河水、池水、湖水。 2．培养基：乳糖蛋白胨培养基，三倍浓缩乳糖蛋白胨培养基，伊红美蓝琼脂培养基(配制方法见附录)。 3．玻璃器具：500ml锥形瓶1个，250ml锥形瓶1个，试管(15×150mm)7支，大试管，1ml移液管，l0ml移液管1支，培养皿3-4副。 4．仪器及其相关用品：显微镜，吸水纸．擦镜纸，接种环。 5．发酵管和小试管。

乳糖蛋白胨培养基 蛋白胨 10g 牛肉膏 3g 乳糖 5g 氯化钠 5g 溴甲酚紫乙醇溶液(16g/L) 1mL 蒸馏水 1000mL pH： 7.2~7.4 灭菌条件：0.072Mpa（1150C，20min）

实验步骤 1．水样的采取和保藏 2．水源水的检测 (1)稀释水样 (2)初发酵实验 (3)平板划线分离 (4)复发酵实验 (5)根据确认的阳性管(瓶)数，查教材P450附录六表-3，计算每升水样中的大肠菌群数。

思考题 1.检查饮用水中的大肠菌群有何意义？ 2.实验过程中有什么问题，你认为原因何在，如何克服？

实验九 环境中特殊微生物的 分离鉴定 实验目的 实验九 环境中特殊微生物的 分离鉴定 实验目的 本实验是从肥沃土壤中分离出来的好氧反硝化菌为材料，进行菌体形态、菌落形态特征的观察，以及生理生化分析。以了解好氧反硝化菌大体由哪些类群的微生物所组成,为实际的好氧反硝化脱氮工艺提供必要的理论依据。

实验器材 1. 实验材料 土壤样品 2. 培养基 按照C/N=4的原则所采用的异养反硝化培养基 3. 器材 恒温摇床，电子天平，恒温培养箱等

实验步骤 1、土壤悬液的制备 称取l0g土样，放入盛有90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振荡使土样与水充分混匀，静置沉降，备用。 2、好氧反硝化菌的富集 吸取10ml土壤悬液，接种于90ml异养反硝化液体培养基中，置于37℃摇床中振荡培养24~48小时。 3、好氧反硝化菌的分离 (1) 用接种环挑取1环富集发酵液，于异养反硝化固体培养基平板上划线后，置于37℃恒温培养箱中培养48小时。 (2) 将培养物在平板上反复划线，直至挑选出在平板上生长快的单菌落，得到纯菌株。 (3) 对单菌落染色后，显微镜镜检。 4、菌种鉴定

实验作业 通过以上实验步骤，是否从土壤中筛选到了好氧异养反硝化细菌，记录其菌体及菌落特征，通过生理生化实验初步确定其在微生物学上的分类地位。