第四章 发酵工业的无菌技术

本章内容 一、概念 二、发酵工业污染的防治策略 三、发酵工业的无菌技术 四、培养基及设备灭菌 五、空气除菌

一、概念:灭菌、消毒、除菌、防腐 灭菌(sterilization):用化学或物理方法杀死物料或设备中所有有生命物质的过程。 消毒(disinfection):用物理或化学方法杀死空气、地表以及容器和器具表面的微生物。 除菌(degermation): 用过滤方法除去空气或液体中的微生物及其孢子。 防腐(antisepsis): 用物理或化学方法杀死或抑制微生物的生长和繁殖 。 消毒与灭菌的区别 消毒与灭菌在发酵工业中的应用

二、发酵工业污染的防治策略 （一）污染的危害 （二）污染的防治

1.染菌的不良后果 消耗营养 合成新产物；菌体自溶、发粘等造成分离困难 改变pH 分解产物 噬菌体破坏极大

2.染菌危害的具体分析 （1）染菌对不同菌种发酵的影响 A．细菌 谷氨酸：发酵周期短，培养基不太丰富，较少染杂菌，但噬菌体威胁大。 肌苷：缺陷型生产菌，培养基丰富，易染菌，营养成分迅速被消耗，严重抑制菌生长和合成代谢产物。

（1）染菌对不同菌种发酵的影响 B. 霉菌 PenG：青霉素水解酶上升，PenG迅速破坏，发酵一无所获。 柠檬酸：pH2.0，不易染菌，主要防止前期染菌。 C. 酵母菌: 易污染细菌以及野生酵母菌 D. 疫苗：无论污染的是活菌、死菌或内外毒素，都应全部废弃。

（2）染菌种类对发酵的影响 青霉素：怕染细短产气杆菌 链霉素：怕染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌 四环素：怕染双球菌、芽孢杆菌和荚膜杆菌 柠檬酸：怕染青霉菌 肌苷（酸）：怕染芽孢杆菌 谷氨酸：怕染噬菌体，易造成连续污染

（3）不同发酵时期染菌对发酵的影响 种子扩大时期染菌: 发酵前期染菌： 发酵中期染菌：挽救困难，应早发现，快处理 ，处理方法应根据各种发酵的特点和具体情况来决定 抗生素发酵 柠檬酸发酵 a. 污染细菌：加大通风，加速产酸，调pH3.0，抑制细菌 b. 污染酵母：加入0.025~0.035g/L CuSO4抑制酵母；通风加大，加速产酸。 灭菌后弃去 应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分，重新接种

c.染黄曲霉：加入另一罐将近发酵成熟的醪液，pH下降，黄曲霉自溶。 （3）不同发酵时期染菌对发酵的影响 柠檬酸发酵 c.染黄曲霉：加入另一罐将近发酵成熟的醪液，pH下降，黄曲霉自溶。 d.青霉菌：在pH很低下能够生长。提前放罐。 发酵后期污染 染菌量不太多，可继续发酵 污染严重，则提前放罐 杀菌剂的添加：前期无必要，增加成本； 发现后加入，效果要具体评价

（4）杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响 丝状菌发酵被产酸菌污染：pH不断下降，菌丝大量自溶，发酵液粘度增加，过滤困难 处理方法：①将发酵液加热后再加助滤剂；②先加絮凝剂使蛋白质凝聚后沉淀 杂菌分泌较多蛋白质杂质时，对发酵后处理过程中采用溶媒萃取的提取工艺非常不利，使水相和溶媒之间极易发生乳化

1. 染菌的检查与判断 显微镜检查法 镜检出杂菌需要一定时间 平板划线培养或斜面培养检查法：菌落 噬菌体检查可采用双层平板法：噬菌斑 肉汤培养检查法 发酵过程的异常现象判断 DO2水平异常变化 pH异常变化 尾气CO2异常变化

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2. 污染原因分析 主要原因： ① 种子带菌 ② 无菌空气带菌 ③ 设备渗漏 ④ 灭菌不彻底 ⑤操作失误 ⑥技术管理不善  

2. 污染原因分析 从污染时间看：早期污染可能与①②④⑤→接种操作不当有关；后期污染可能与③⑤及中间补料有关。 从杂菌种类看： 耐热芽孢杆菌：与④有关 球菌、无芽孢杆菌：与① ② ③⑤有关 浅绿色菌落的杂菌：与水有关，即冷却盘管渗漏 霉菌：与④⑤有关，即无菌室灭菌不彻底或操作问题 酵母菌：糖液灭菌不彻底或放置时间较长 从染菌幅度看：各个发酵罐或多数发酵罐染菌，且所污染的是同一种杂菌，一般是空气系统问题，若个别罐连续染菌，一般是设备问题。

3. 预防 种子带菌的防治 灭菌彻底 接种可靠：无菌室及设备可靠，无菌操作可靠 保藏可靠 过滤空气带菌的防治 设备的渗漏或“死角”造成的染菌及其防治

“死角” 发酵罐的“死角” 法兰、内衬、接口、表头、罐内部件及其支撑件如搅拌轴拉杆、联轴器、冷却盘管、挡板、空气分布管及其支撑件 口：人孔（或手孔）、排风管接口、灯孔、视镜口、进料管口 发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角” 消除方法：加强清洗并定期铲除污垢；安装放汽边阀 管道安装不当或配置不合理形成的“死角”

发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角”

法兰连接不当造成的“死角”

灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方法

3. 预防 培养基与设备灭菌不彻底的防治 原料性状：大颗粒的原料过筛除去。 实罐灭菌时要充分排除罐内冷空气。 灭菌过程中产生的泡沫造成染菌：添加消泡剂 防止泡沫升顶 连消不彻底 ：最好采用自动控制装置 灭菌后期罐压骤变 死角 操作不当造成染菌 噬菌体染菌及其防治

采取哪些措施能够保持无菌发酵？ 物料、培养基、中间补料要灭菌； 发酵设备及辅助设备（空气过滤装置、各种发酵罐进出口连接装置）和管道要灭菌； 好气发酵通入的空气要除菌； 种子无污染；接种无菌操作过关； 为了保持发酵的长期无菌状态，需维持正压。

三、发酵工业的无菌技术——灭菌方法 干热灭菌法 湿热灭菌法 射线灭菌法 化学药剂灭菌法 过滤除菌法 火焰灭菌法

四、培养基及设备灭菌 （一）湿热灭菌原理 （二）分批灭菌（实罐灭菌） （三）连续灭菌（连消） （四）分批灭菌与连续灭菌的比较

（一）湿热灭菌原理 1. 热阻 2. 微生物热死定律：对数残留定律 3.灭菌温度和时间的选择 4. 影响培养基灭菌的其它因素

1. 热阻 定义：微生物对热的抵抗力称为热阻，可用比死亡速率常数k来表示 。 k↓，热阻↑, t↑

1. 热阻 当温度T一定时，k随微生物不同而不同，具体计算时，可取细菌芽孢的k值为标准。 k=Aexp(- △E/RT) ∴ k与微生物活化能及T有关

大肠杆菌在不同温度下 的残留曲线 嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢在不同温度下的死亡曲线

2. 微生物热死定律： (1) 对数残留定律 在一定温度下，微生物受热致死遵循分子反应速度理论，微生物受热死亡的速率-dN/dt与任何瞬间残留的活菌数N成正比，即 当Nt=0时， t=∞， 既无意义，也不可能。 一般采用Nt=0.001，即1000次灭菌中只有一次失败。

(2) 非对数残留定律 某些微生物受热死亡的速率不符合对数残留定律：如一些微生物芽孢。 式中NR：耐热性活芽孢数；Ns：敏感性活芽孢数 kR ks NR Ns ND dNR/dt=-kR NR dNs/dt =kR NR -ks Ns →Nt/N0=KR/(kR-kS) [ekst-ks/kR e-kRt] 式中NR：耐热性活芽孢数；Ns：敏感性活芽孢数 ND：死亡的芽孢数；kR：耐热性芽孢的比死亡速率； ks：敏感性芽孢的比死亡速率； N0：初始活芽孢数。

培养基中含有大量的不耐热的微生物和相当数量的耐热性微生物时的灭菌残留曲线 ∴在T相同时，对数与非对数定律的灭菌时间t不同。

3. 灭菌温度和时间的选择 培养物质受热破坏也可看作一级反应： 式中C：对热不稳定物质的浓度；k’：分解速度常数； 都与相应的活化能及T有关

3. 灭菌温度和时间的选择 当T1 →T2 ㏑(k2/k1)/㏑(k2’/k1’)=ΔE/ΔE’>1 (∵ΔE>ΔE’)

4. 影响培养基灭菌的其它因素 培养基成分 油脂、糖类及一定浓度的蛋白质、高浓度有机物等增加微生物的耐热性 低浓度（1%-2%）NaCl对微生物有保护作用，随着浓度增加，保护作用减弱，当浓度达8%-10%以上，则减弱微生物的耐热性。

4. 影响培养基灭菌的其它因素 pH：pH6.0-8.0，微生物最耐热，pH<6.0，H+易渗入微生物细胞内，改变细胞的生理反应促使其死亡。∴培养基pH愈低，灭菌所需时间愈短。 培养基的物理状态 泡沫：泡沫中的空气形成隔热层，对灭菌极为不利，可加入少量消泡剂 。 培养基中的微生物数量

（二）分批灭菌（实罐灭菌） 1.灭菌工艺过程 夹套或蛇管排冷水，开启排气管阀，空气管通蒸汽，也可夹套内通蒸汽 分空气过滤器灭菌 并用空气吹干 （二）分批灭菌（实罐灭菌） 1.灭菌工艺过程 夹套或蛇管排冷水，开启排气管阀，空气管通蒸汽，也可夹套内通蒸汽 达70℃左右 分空气过滤器灭菌 并用空气吹干 保温阶段，凡液面以下各管道都应通蒸汽，液面上其余各管道则应排蒸汽，不留死角，维持压力、温度恒定 取样管 120℃，1×105pa 通蒸汽 放料管 保温 保温结束，依次关闭各排汽、进汽阀门 罐压接近空气压力 向罐内通无菌空气 夹套或蛇管中通冷水 培养基降温到所需温度

2. 灭菌时间的估算 升温、冷却两阶段也有一定的灭菌效果，考虑到灭菌的可靠性主要在保温阶段进行，故可以简单地利用式 ㏑(N/N0) =-kt 来粗略估算灭菌所需时间。

2. 灭菌时间的估算 例1：有一发酵罐内装40m3培养基，在1210C温度下实罐灭菌，原污染程度为每1ml有2×105个耐热细菌芽孢，已知1210C时灭菌速度常数k=1.8min-1，求灭菌失败机率为0.001时所需时间。 解：N0=40×106×2×105=8×1012(个) Nt=0.001(个) k=1.8(min-1) ㏑(Nt/N0)=-kt t=2.303/k[lg(N0/Nt)]=2.303/1.8[lg(8×1015)] =20.34(min) 由于升温阶段就有部分菌被杀灭，特别是当培 养基加热至1000C以上，这个作用较为显著， 故实际保温阶段时间比计算值要短。

（三）连续灭菌（连消） 工艺流程 喷淋冷却连续灭菌流程 喷射加热连续灭菌流程 薄板式换热器连续灭菌流程 灭菌时间的计算 ㏑(Ct/C0)=－kt t=2.303/k[lg(C0/Ct)] 式中：C0、Ct分别为单位体积培养基灭菌前、后 的含菌数。  

连续灭菌时间的估算 例2．某发酵罐内装40m3培养基，采用连续灭菌，灭菌温度为1310C，原污染程度为每1ml含有2×105个杂菌，已知1310C时灭菌速度常数为15min-1，求灭菌所需的维持时间。 解：C0=2×105(个/ml) Ct=0.001/(40×106)=2.5×10-11(个/ml) t=2.303/k[lg(C0/Ct)]=2.303/15×lg[(2×105)/(2.5×10-11)] =2.37 min

喷淋冷却连续灭菌流程

分批灭菌与连续灭菌的比较 连续灭菌的优点：（适用于大型罐） 可采用高温短时灭菌，营养成分破坏少，有利于提高发酵产率； 发酵罐利用率高； 蒸汽负荷均衡； 采用板式换热器时，可节约大量能量； 适宜采用自动控制，劳动强度小； 可实现将耐热性物料和不耐热性物料在不同温度下分开灭菌，减少营养成分的破坏。

分批灭菌与连续灭菌的比较 缺点： 对小型罐无优势，不方便，对设备要求高； 蒸汽波动时灭菌不彻底； 当培养基中含有固体颗粒或有较多泡沫时，以分批灭菌好，防止灭菌不彻底。

五、空气除菌 （一）概述 （二）空气过滤除菌流程 （三）空气预处理 （四）空气预处理流程设计应用举例 （五）空气过滤介质 （六）空气过滤除菌原理 （七）提高过滤除菌效率的措施

（一）概述 空气除菌的必要性 以一个50m3的发酵罐为例，若装料系数为0.7，要求每立方米发酵液每分钟通气0.8m3，培养周期170h，那么每个周期需通气量2.86×105 m3(50×0.7 × 0.8 × 170 × 60)，而每立方米大气中约有103-104个微生物。

（一）概述 空气除菌方法 辐射杀菌：超声波、高能阴极射线，x射线、β射线、γ射线、紫外线(2265Å ~3287 Å) 加热杀菌：加热方法可用蒸汽、电和空气压缩机产生的热量 静电除菌 ：常用于洁净工作台、洁净工作室所需无菌无尘空气的第一次除尘，配合高效过滤器使用。 过滤除菌：采用定期灭菌的介质来阻截流过的空气所含的微生物而取得无菌空气。常用的过滤介质有棉花、活性炭、玻璃纤维、有机合成纤维、有机和无机烧结材料等等。

1. 对空气过滤除菌流程的要求 流程主要设备：空气压缩机 、空气过滤器 附属设备：粗过滤器、气液分离器、空气贮罐、空气冷却器

1. 对空气过滤除菌流程的要求 流程的制定应根据所在地的地理、气候环境和设备条件综合考虑 环境污染比较严重的地方，要考虑改变吸风的条件； 在温暖潮湿的南方，要加强除水设施 ； 压缩机耗油严重的设备流程中则要加强消除油雾的污染 ，也可采用无油润滑的往复式压缩机； 往复式压缩机，要配备前置粗过滤器及空气贮罐。 通常要求压缩空气的相对湿度Φ=50%~60%时通过过滤器为好。

2. 空气除菌流程的分析 空气除菌系统包括：冷却、分离油水、加热、 过滤 几种典型的设备流程 两级冷却、加热除菌流程 空气除菌系统包括：冷却、分离油水、加热、 过滤 几种典型的设备流程 两级冷却、加热除菌流程 冷热空气直接混合式空气除菌流程 高效前置过滤空气除菌流程 将空气冷却至露点以上的流程 利用热空气加热冷空气流程 一次冷却和析水的空气过滤流程     

（三）空气预处理 1. 原理： 除尘(外源空气的前处理)：防塞，提高过滤效率和滤器寿命； 措施：建吸风塔、粗过滤器（布袋过滤器、 降温：防烧伤介质及水分蒸发严重，对发酵不利 除油、除水：防塞（因油膜堵），防止过滤器长菌堵塞（因水滴） 加热：保持相对湿度 稳压：防止压力波动，贮罐 2. 预处理流程设计的简繁关键：去湿问题 措施：建吸风塔、粗过滤器（布袋过滤器、 填料过滤器、油浴洗涤和水雾除尘装置等）、高效前置过滤器

两级冷却、加热除菌流程图 1-粗过滤器；2-空压机；3-贮罐；4，6-冷却器；5-旋风分离器；7-丝网分离器； 8-加热器；9-过滤器

冷热空气直接混合式空气除菌流程图 1-粗过滤器；2-压缩机；3-贮罐；4-冷却器；5-丝网分离器；6-过滤器

利用热空气加热冷空气的流程示意图 1-高空采风；2-粗过滤器；3-压缩机；4-热交换器；5-冷却器；6，7-析水器；8-空气总过滤器；9-空气分过滤器

将空气冷却至露点以上的流程 1－高空采风；2－粗过滤器；3－压缩机；4－冷却器；5－冷却器；6－空气总过滤器；7－空气分过滤器

高效前置过滤空气除菌流程图 1—高效前置过滤器；2—压缩机；3—贮罐；4—冷却器；5—丝网分离器；6—加热器；7—过滤器

一次冷却和析水的空气过滤流程示意图 1－高空采风；2－粗过滤器；3－压缩机；4－冷却器；5，6—析水器；7—贮罐；8—加热器；9—空气总过滤器；10—空气分过滤器

空气压缩和压缩空气的冷却 空气的压缩过程可看作绝热过程，故压缩后的空气温度与被压缩的程度有关： T2=T1(P2/P1)(k-1)/k 式中 T1,T2——压缩前后空气的绝对温度，K P1,P2—— 压缩前后空气的绝对压强，Pa k——绝热指数，空气为1.4 若压缩为多变过程，则可用多变指数m（对于 空气m=1.2-1.3）代替绝热指数k。

例3：20oC的大气被压缩至表压 2.5kg/cm2时温度是多少？ 解：T1=20+273=293k P2/P1=（2.5+1.033）/1.033=3.42 m=1.3 T2=T1(P2/P1)(m-1)/m=293×3.420.3/1.3=389k ∴t2=389-273=116oC

空气预处理流程设计

3. 几个概念 空气的绝对湿度：1m3 湿空气中含有的水蒸气绝对量(kg) 空气的相对湿度（Φ）：空气的绝对湿度与同温度下饱 和绝对湿度之比值或者空气中水蒸汽分压与同温度时的 饱和水蒸汽压之比值，称为空气的相对湿度。 Φ=Pw/Ps 式中 Pw——空气中水蒸气分压， Pa Ps——同温度下水的饱和蒸气压，Pa， 它可由各类手 册中查到。 空气的湿含量（X）：1kg干空气中含有的水汽量 （kg/kg干空气）

空气的湿含量（X） 设Gg kg干空气中含Gw kg水蒸汽时，则 X=Gw/Gg 又Pw/Pg=nw/ng=(Gw/Mw)/(Gg/Mg) =(Gw/Gg)·(Mg/Mw) （Mw，Mg分别为水和空气的分子量） ∴X=Gw/Gg=(PwMw)/(PgMg)=(18/28.94)·(Pw/Pg) =0.622Pw/(P-Pw) （4-1）

（1）Φ与X的关系 将ΦPs=Pw代入式4-1中得 X=0.622ΦPs/（P-ΦPs） 所以，已知某一温度T时Φ值，便可求得X。 ①当X一定时，T1→T2，导致Φ1→Φ2 ，则 X1=0.622Φ1Ps1/(P1-Φ1Ps1) X2=0.622Φ2Ps2/(P2-Φ2Ps2) ∵X1=X2 ∴Φ2=Φ1(PS1/PS2)(P2/P1) （式4-2）

（1）Φ与X的关系 ②当X发生变化，即有水析出时，X降低，此时Φ2=100%， 定义：当Ф=1时，空气中水蒸气已饱和，此时温度称为露点Td。 当T<Td时，有水析出，X ↓ 。 当ΔX=0时，压缩过程中，随着T↑，Ps↑，P↑，Ф↓； 降温过程中，随着T↓ ，Ps↓ ，P一定，Ф↑ 。

思考题 压缩空气的露点比原始空气的露点更高，即更易析出水分，且压缩比愈大，露点愈高，为什么？

思考题答案： 由 可知当 ＝1时，求出 Ps2 对应 Td Ps2 愈高， Td 愈高 而 ∴压缩空气的露点 比原始空气 高( P2>P1) 压缩比 愈大，露点愈高

加热后空气的温度 设析出水后，在升温阶段ΔX=0，根据式4-2可以求出析水后应升温到多少度才能满足相对湿度保持50-60%。 ∵ Φ后= ΦdPsd/Ps后 ∴ Ps后= ΦdPsd/ Φ后 Ps后→T后

例4：温度20℃、Φ=85%的空气，当压缩至2.0kg/cm2时，温度为120℃，求此时空气相对湿度是多少？若在压力不变的情况下将温度冷却至40℃后，相对湿度又是多少？ 已知：20℃时，Ps1=0.0238 kg/cm2,120℃时，Ps2=2.025 kg/cm2 ，40℃时，Ps3=0.0752 kg/cm2 解：120℃时，相对湿度为 40℃时，相对湿度为

例5：若将例4中空气继续冷却，至水析出，求露点td？（假定压力不变） 解：已知Φ4＝100%，X一定，P一定 由 所以 查蒸汽压表，0.059 kg/cm2饱和蒸汽压对应温度td＝35℃。 所以，当t<35℃，继续冷却时，有水析出。

例6：若将例5中的空气冷却至28℃（压力不变），求其湿含量为多少？并求每公斤干空气将析出多少水分？（已知：28℃时，Ps5＝0 例6：若将例5中的空气冷却至28℃（压力不变），求其湿含量为多少？并求每公斤干空气将析出多少水分？（已知：28℃时，Ps5＝0.0385 kg/cm2） 解： 而最初 所以，每公斤干空气将析出水分： ΔX＝X1-X5＝0.0124-0.0080＝0.0044㎏水

例7：若将例6中空气加热至38 ℃时，求其Φ6？ （38 ℃时，Ps6＝0.0675 kg/cm2） 解：升温时X不变，Φ5→Φ6时Φ值下降 也可根据X6＝X5＝0.0080 不变，由 得

（五）空气过滤介质 棉花 玻璃纤维 活性炭 超细玻璃纤维纸 石棉滤板 烧结材料过滤介质 新型过滤介质

（六）空气过滤除菌原理

（六）空气过滤除菌原理 布朗扩散截留作用 拦截滞留作用 惯性碰撞滞留作用 重力沉降作用 静电吸引作用

（七）提高过滤除菌效率的措施 减少进口空气的含菌数量，主要方法：正确选择进风口；提高进口空气的采气位置；采用粗过滤预处理。 设计和安装合理的空气过滤器，选用除菌效率高的过滤介质。 针对不同地区，设计合理的空气预处理工艺流程，以达到除油、水和杂质的目的 。

（七）提高过滤除菌效率的措施 降低进入空气过滤器的空气相对湿度，保证过滤介质能在干燥状态下工作，主要方法：使用无油润滑的空气压缩机；加强空气冷却和去除油、水；提高进入过滤器的空气温度。 稳定压缩空气的压力，采用合适容量的贮气罐。

本章小结 掌握有关无菌技术的基本概念 了解发酵工业污染的原因及其防治策略 掌握培养基及设备灭菌的基本原理、基本方法及灭菌时间的估算 掌握空气除菌基本原理、流程及空气预处理设计