PCR & Kary B. Mullis PCR & Kary B. Mullis 2010级化学基地班 张为宁.

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PCR & Kary B. Mullis PCR & Kary B. Mullis 2010级化学基地班 张为宁

PCR & Kary B. Mullis

前 言 关于为什么想讲接下来的内容: 1.PCR是分子生物学的关键技术,又是常规技术。PCR技术的出现极大的推动了分子生物学的发展,旋即被推广和应用到生命科学的其他领域。广泛的应用带动了PCR技术的发展,PCR技术的发展又产生了新的应用。如此螺旋上升,使PCR技术在20年的时间里,从无到有,从只能单纯扩增已知两端序列之间的DNA片段,发展到应用于各个领域的几十种PCR方法,而且这种发展还在继续。 PCR最新技术原理、方法及应用(第二版),2011 关于为什么想讲接下来的内容: 2.鉴定DNA的方法“PCR法”已经成为从遗传学到分子生物学,甚至到医疗领域最前沿的现代科学的基本手段。这个技术的开发者,美国的凯利·穆利斯是个狂热的冲浪爱好者,曾结过四次婚,是一位对科学的“主流”置之不理的具有自由思想的生化学家,他曾主张艾滋病的致病原因不是HIV,并声称二氧化碳致使地球变暖的学说是错误的,但鉴于他对现代社会的绝对性贡献,诺贝尔奖委员会在1993年还是决定授予他诺贝尔化学奖。 诺贝尔奖中的科学:化学奖卷,2012

具体内容包括 Part 1. Something about PCR Part 2. Something about Mullis

目 录 Contents 1 发展简史 2 基本原理 基本原理 3 主要应用 4 Kary简介 5 一点感想

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)一个非常简单,然而却是很有用的体外DNA聚合反应。PCR技术在生命科学中掀起了一场革命,它可以使人们通过几个小时的试管内的DNA聚合反应,就可将DNA扩增109倍。通过PCR技术不仅可以扩增存在于样品中的DNA,也可以富集混合DNA分子中的任一种。PCR的重要价值在于扩增存在微量而特殊的DNA序列。

1971年,Khorana曾提出:经过DNA变性,与合适引物杂交,用DNA聚合酶延伸引物,并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。 PCR技术的创建 Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。 1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。 1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶(Taq)引入了PCR技术。 1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。

PCR的发展史 Mullis做的有关工作 1983年春,Mullis发展出PCR的概念; 1983年9月,Mullis用大肠杆菌DNA聚合酶做了第一个PCR实验,只用一个循环; 1983年12月,用同位素标记法看到了10个循环后的49 bp长度的第一个PCR片断; 1985年12月20日,Mullis的同事Saiki在Science上发了一篇论文,方法中用了PCR技术,导致Mullis的文章到处被拒; 1985年10月25日申请了PCR的专利,1987年7月28日批准(专利号4,683,202 ),这回Mullis是第一发明人。 1986年5月,Mullis在冷泉港实验室做专题报告,全世界从此开始学习PCR的方法; 1986年6月,Cetus公司纯化了第一种高温菌DNA聚合酶,Taq DNA polymerase,这是85年春天Mullis建议做的; 1988年,第一台PCR仪问世; 1991年,Hoffman LaRoche以3亿美元的代价从Cetus公司获得全权开发权。

PCR的基本原理 PCR(聚合酶链式反应,polymerase chain reaction)的基本工作原理是以拟扩增的DNA分子为模板,以一对分别与模板相互补的寡核苷酸片段为引物,在DNA聚合酶作用下,按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。不断重复这一过程,可以目的DNA片段得到扩增。因为新合成的DNA也可以作为模板,因为PCR可以使DNA的合成量呈指数增长。

PCR基本反应体系 反应体系 1.模板 7.PCR促进剂 2.特异性引物 6.耐热DNA聚合酶 3.反应缓冲系统 5.三磷酸脱氧核苷酸 4.二价阳离子

简单介绍: 1.模板 PCR模板可以是DNA,也可以是RNA(需先经过反转录生成cDNA) 要求: 纯化的模板,单链或双链,线性DNA,小片段(扩增效率高),适宜模板量(eg:哺乳动物基因组1μg,酵母10ng,细菌1ng,质粒基因组1pg) 2.引物 PCR扩增产物的大小及扩增靶序列在基因组中的位置是由引物限定的→引物的选择关系到PCR的特异性。通常体系中有一对引物,即5’端引物和3’端引物。扩增时,5’端引物与位于待增片段5’ 端上游的一小段DNA序列相同,引导信息链的合成;3’端引物与位于待增片段3’端下游的一小段序列互补,引导互补链的合成,PCR扩增产物为一对引物之间的双链DNA片段。 要求: 高质量的引物且需要纯化,精心设计:长度、基本成分、引物自身、引物之间、3’末端、5’末端、熔解温度、特异性、简并性等(计算机软件),用量及计算(一般要求0.1~0.5μmol)

简单介绍: 3.反应缓冲系统 提供PCR所必需的、合适的酸碱度和某些离子。 最常用:10~50mmol/L Tris-HCl(pH8.3~8.8,20℃),72℃(通常 PCR延长阶段的温度)pH7.2;实际反应体系中,pH6.8~7.8 还含有KCl,50mmol/L以内有利于引物退火。 还可加入Taq聚合酶保护剂 4.二价阳离子——Mg2+ 所有耐热的DNA聚合酶的活性都需要二价阳离子(通常是Mg2+),此外Mg2+浓度影响引物退火、模板与PCR产物解链温度、产物特异性、引物二聚体生成等(Mg2+总量应比dNTP浓度高0.2~2.5mmol/L) 5.三磷酸脱氧核苷酸(dNTP) 四种dNTPs为PCR的合成原料。 在标准的PCR中各种dNTP的浓度应相等,若浓度有明显差异时,会诱发聚合酶的错误掺入而降低链合成的速度。dNTP的浓度直接影响PCR的速度和特异性,应严格控制。

简单介绍: 6.耐热DNA聚合酶 能经受95℃以上的高温而不失活,因而无需再每轮循环中添加新酶;同时催化的聚合反应的最适温度为70~80℃,此时引物与模板结合的特异性好,故产物纯度高。 现已发现多种耐热DNA聚合酶,性能尚有差别。应用最多Taq pol(Taq DNA聚合酶,台籍科学家钱嘉韵分离得到):高热稳定性、高催化活性、忠实性、反转录活性、非模板依赖的聚合活性。 其他:修饰Taq DNA聚合酶、Th DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶 Sac DNA聚合酶 Pfu DNA聚合酶 7.PCR促进剂 据报道通过系那个PCR体系中加入助溶剂和添加剂,可以降低碱基错配水平,提高富含GC模板的扩增效率。 常见:DMSO、甘油、TMAC 大多数PCR促进剂在浓度较高时对PCR的反应起抑制作用 PCR理论与技术(第二版),2009

操作步骤 1.在冰浴中,按以下次序将各成分加入一无菌0 操作步骤 1.在冰浴中,按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。         10×PCR buffer                5 μl         dNTP mix (2mM)              4 μl        引物1(10pM)                 2 μl        引物2(10pM)                 2 μl         Taq酶 (2U/μl)              1 μl         DNA模板(50ng-1μg/μl)     1 μl         加ddH2O至                     50 μl     视PCR仪有无热盖,不加或添加石蜡油。 2. 调整好反应程序。将上述混合液稍加离心,立即置PCR仪上,执行扩增。一般:在93℃预变性3-5min,进入循环扩增阶段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,循环30-35次,最后在72℃ 保温7min。 3. 结束反应,PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。 4.PCR的电泳检测:如在反应管中加有石蜡油,需用100μl氯仿进行抽提反应混合液,以除去石蜡油;否则,直接取5-10μl电泳检测。 dH2O 蒸馏水;ddH2O 重蒸水,即经过两次蒸馏的水,一般应用于比较精密的实验,如分子生物学实验中试剂的配制。

PCR的基本原理 1 2 3 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间(min) 温度 (℃) 高温变性 1 低温退火 2 适温延伸 3 重复1~3步 25~30轮 形成2条单链 DNA变性 目的DNA片段 扩增100万倍以上 子链延伸 DNA加倍 DNA单链 与引物复性 DNA双螺旋

PCR循环(三个阶段) 变性 退火(复性) 延伸 能否成功的使模板DNA和PCR产物变性是反应成败的关键。 延伸即寡核苷酸引物的延长。延伸的温度和时间影响结果。

变性 ①模板DNA的变性:模板DNA经加热至94℃1min后,模板DNA双链即解离成为单链,以便之后引物结合,为下轮反应作准备

退火 ②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至54℃ 45s,以便使引物与模板DNA单链的互补序列配对结合

延伸 ③引物的延伸:DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,于72℃左右,以dNTP为反应原料,DNA序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链

PCR 动画 过 程 变 性 引 物 退 火 DNA 复制 1st cycle 2nd cycle 3rd cycle

PCR产物的检测 1.凝胶电泳检测(最常用、最简便) 琼脂糖凝胶电泳;聚丙烯酰胺凝胶电泳 2.核酸探针杂交检测 放射性标记和非放射性标记、 3.酶谱分析法 4.DNA酶免疫试验法 5.PCR-酶联免疫试验法 6.颜色互补分析法 7.序列分析法(最精确、最繁琐) 8.PCR-HLPC法,等。

PCR技术的特点:高特异性 引物的特异性。 引物延伸时,碱基配对的正确性。 Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性。 靶基因的特异性与保守性。选择扩增特异性和保守性高的靶基因区域,扩增产物的特异性程度就更高。 作为临床测定的PCR方法,还有一个影响特异性的决定性因素是寡核苷酸杂交探针。

PCR技术的特点:高灵敏度 从理论上,其能在2~3小时内,将1个分子靶DNA,扩增至10亿个分子。

PCR技术的特点:简便快速 整个PCR的扩增在一个小小的离心管中完成,过程也只是简单的温度变化,耐高温的Taq DNA聚合酶的应用,避免了DNA聚合酶的反复加入。 整个扩增反应可在2~4 小时完成。

特定的低纯度标本也可使用 某些靶基因含量高的标本,如人的组织、细胞、毛发、血液、培养后的细菌和病毒等病原体等,DNA粗制品及总RNA即可作为扩增模板,但在具体的扩增时,可对标本进行适当的稀释,在不影响靶基因模板的扩增浓度下,降低标本中PCR抑制物的浓度,以利于靶基因的扩增。

PCR的主要应用 基础研究方面的应用 临床上的应用 法医学中的应用 在其他方面的研究:流行病学研究、动物检疫和环境微生物检测等 亲子鉴定 个体识别 1、扩增目的基因和检定重组子 2、克隆基因 3、基因功能的和表达调控研究 4、基因组测序 5、致突变 1、在遗传性疾病诊断上的应用 2、在肿瘤研究中的应用 3、检测病原体 4、在基因分型中的应用 在其他方面的研究:流行病学研究、动物检疫和环境微生物检测等

在遗传与分子生物学中的应用 1制备与筛选CDNA文库 2直接测定DNA序列 3克隆染色体上特异性片段 4介导与检测基因突变 5克隆未知序列 6寻找新基因 7构建连锁图谱

PCR技术在医学上的应用 病原体核酸的检测:定量(抗病毒药物治疗疗效监测);定性(耐药突变、基因分型、血液筛查等)。 遗传病 肿瘤 个体鉴定 其他(SNP及涉及核酸的科研等)

在感染性疾病病原体检测中的应用 定性(耐药突变、基因分型、血液筛查等) 难培养菌 耐药基因 病毒的检测 定量(感染状况判断、抗病毒药物治疗疗效监测) 定性(耐药突变、基因分型、血液筛查等) 细菌及其它微生物的检测 难培养菌 耐药基因 寄生虫的检测

在遗传病及其它基因相关疾病诊断中的应用 α地中海贫血 α地贫的发生是由于α珠蛋白链基因突变的结果,α珠蛋白基因定位于第16染色体短臂,每条染色体上均有两个α珠蛋白基因,该基因总长30Kb,共包含七个连锁的α类基因或假基因。 在α-基因的突变中,以缺失型突变最为常见。α-基因的另一突变即为点突变,目前已发现的突变有18种以上,它包括错义突变、无意突变、剪接部位突变及起始信号突变。 α地贫的产前诊断目前一般采用PCR-探针杂交或限制性长度多态性(RFLP)方法进行。 30

β地中海贫血 β地中海贫血(简称β地贫):β地贫由β珠蛋白链基因突变所引起,该基因定位于第11染色体短臂,总长度约60Kb,其中有许多胚胎性基因及假基因,而β珠蛋白基因有两个内含子和3个外显子,总长约为1.126Kb. β-基因的突变以点突变为主,亦有碱基的插入和缺失。目前在世界范围内发现的点突变达160余种,其中在中国发现的有21种。 β地贫的产前诊断目前一般采用PCR-探针杂交或限制性长度多态性(RFLP)或等位基因特异的PCR方法进行。 31

血友病 血友病是一种X连锁隐性遗传病,分为血友病甲和血友病乙,几乎全部发生在男性身上。血友病甲是由于凝血因子Ⅷ的缺乏所致,而血友病乙则是因为缺乏凝血因子Ⅸ。控制产生凝血因子Ⅷ和Ⅸ的基因位于X性染色体上。 32

血友病的分子诊断 大多数血友病突变的大量变异和近代起源使遗传筛选过程错综复杂。目前基本上使用PCR方法检测。 诊断携带者的最佳途径是检测其家庭成员的特异基因缺陷。 策略:根据全国性可信基因突变和谱系数据库进行筛选,鉴定并记录每一个家庭中的病人或携带者的突变。这样,根据个人所属家庭,只有小部分血友病基因需要检查,所以可以迅速而准确地筛选每一个家庭成员并降低成本。 英国和瑞典完全使用这种策略,它代表了利用各种遗传缺陷谱系鉴定遗传性疾病的筛选模式。 33

药物性耳聋 氨基糖甙类抗生素所致的耳聋可分为两类:一类因接受了中毒剂量而致聋;另一类是有遗传背景,即带有线粒体125rRNA基因AI555G均质性点突变基因。由细胞线粒体的遗传基因发生变异之故。即家族的变异基因可能通过母亲遗传给她的子孙,使之具有潜在的过敏性,此称母系遗传。 该突变使原有的BsmAI酶切位点消失 34

药物性耳聋 检测方法主要是运用 PCR技术,结合限制性内切酶进行分析,其更新的技术包括变性高效液相色谱分析等。 35

在亲子鉴定中的应用 每个人的遗传物质一半来自父亲,另一半则来自母亲。根据孟德尔遗传分离和自由组合定律,亲代基因型决定子代基因型,在没有基因突变和分型错误的前提下,孩子不可能带有双亲均没有的等位基因。 父系遗传的Y染色体的标记,子代的分型必定与父亲的相同,而且同一父系的所有个体的分型一致。母系遗传的线粒体DNA,子代的分型与母亲的分型一致,并且同一母系的所有个体的分型一致。 36

在亲子鉴定中的应用 父与子之间仅有一个遗传标志不符合遗传规律尚不能排除亲子关系,因为有可能是突变所致。必须有2个以上不同基因座同时不符才能否定其亲子关系。 亲子鉴定的手段主要有两大类: (1)血液中各种抗原成分的遗传多态性标志物检验,如人类白细胞抗原分型、红细胞抗原分型、红细胞酶型及血清型;(2)DNA多态性检验。主要包括有单基因座探针限制性片段长度多态性(DNA指纹)和单基因座扩增片段长度多态性(包括用多聚酶链反应(PCR) 检测的可变数目串联重复多态性(VNTR)和短串联重复多态性(STR))。 37

在亲子鉴定中的应用 DNA多态性检验是目前亲子鉴定中最准确的一种方法。 如果孩子和被测试男子的DNA模式在两个或多个DNA探针上不吻合,那么被测试男子便被100%排除,即他是亲生父亲的可能性是0%。反之,如果孩子和被测试父亲的DNA模式完全吻合,则在理论上不能100%肯定其为亲生父亲,只能计算出99.95%或更大的概率。 事实上也发生过DNA模式完全吻合但实际并非为生父的情况,但这种情况的可能性极低。 38

在个体鉴别中的应用 基因指纹又称DNA指纹,指的单基因座探针限制性片段长度多态性。DNA所含有的遗传信息是由遗传密码字母A、C、G和T的序列决定的。人类含有总数约30亿个这种字母,它们在人体每个细胞的染色体上都以一定的次序排列,排列次序的不同使得一个个体与另一个个体完全不同。个体间的亲缘关系相距越远,基因组的核苷酸字母排列差异就越大。相反,遗传上相关的个体(如同胞、父子)相应地在其字母序列上有很大的相似性。 39

在个体鉴别中的应用 DNA指纹就是通过分析这种差异来确定个体。 DNA指纹是最可靠的个体确认方法,现已在司法实践中广泛应用,有很多案例的唯一证据就是留在现场的这些藏在细胞内的DNA。 40

在个体化治疗中的应用 细胞色素氧化酶P450(CYP450基因的多态性 细胞色素P450 2D6(Cytochrome P450 2D6,CYP2D6)是细胞色素药物代谢酶中较为重要的一种,由497个氨基酸组成。主要参与多种重要药物的代谢,包括多种抗心律失常药、β1受体阻滞药、抗高血压及三环类抗抑郁药等。CYP2D6参与代谢的药物占总P450代谢药物的30%。 CYP2D6的基因多态性会导致患者代谢药物能力的很大差别。当患者的基因型是CYP2D6*1/*1时,属于强代谢型(EM);当患者的基因型是CYP2D6*1/*10时,属于中等代谢型(IM);当患者的基因型是CYP2D6*10/*10时,属于弱代谢型(PM)。同样是美托洛尔用药的常规剂量为25mg/次,2次/d,对于EM者,推荐剂量为常规剂量的140%;对于IM者,推荐剂量为常规剂量的60%;对于PM者,推荐剂量为常规剂量的30%。 可常规地应用不同的P450基因型来评价新药在临床试验中的疗效。 41

在血液筛检中的应用 HCV和HIV感染“窗口期” HBV DNA PCR检测筛检血液的意义 42

临床PCR检验应用的发展趋势 核酸提取方法的简便化和自动化 项目的多样化:从病原体、到基因疾病的诊断、多标志物同时检测、疾病基因指纹 不同原理的实时核酸扩增仪的普遍应用 扩增试剂的改进:标准化、防污染、有内标阴性质控 临床PCR实验室质量理念不断增强 43

1993年诺贝尔化学奖 凯利·穆利斯 让DNA研究飞跃发展的PCR法 冲浪狂的凯利·穆利斯 刊登在自然杂志上的生化学者的不成熟的宇宙论 尝试合成麻药LSD 探索DNA解读方法的思考试验 开车兜风时想到的PCR法 拒绝刊登此文的自然和科学杂志 价值三亿美元的专利和一万美元的奖金 垂死挣扎的PCR法 对科学家们的误解的指责

很少有在公司工作的科研人员得 诺贝尔奖, Mullis是其中之一 Kary B. Mullis (1944 -),在Cetus公司工作期间,发明了PCR。使DNA扩增的方法早就存在,他曾经想过不少改进办法,但最终的改革是使酶变得耐热。更确切地说,就是同时使用两个寡聚核苷酸引物,然后酶就变得耐热了。这种改革的本身独创性较少,但我认为他的独创性不在改革技术上,而在于想到了改革。独创性较少,却大大提高了旧方法的用途,给人类生活带来了巨大的影响,使革新后的技术面貌一新,赢得了诺贝尔奖。 “如果你的研究能力一般,那么,改革本研究领域中大家习以为常的最基本的技术,你就有可能获诺贝尔奖。” http://nobelprize.org/chemistry/laureates/1993/mullis-lecture.html http://nobelprize.org/chemistry/laureates/1993/mullis-autobio.html Mullis, K.B. (1990) The unusual origin of the polymerase chain reaction. Scientific American. 262 (4) 56-65.

部分资料来自网络 主要参考书目: 诺贝尔奖中的科学:化学奖 PCR理论与技术 PCR最新技术原理、方法及应用 单击添加段落文字

Kary’s Words “如果你的研究能力一般,那么,改革本研究领域中大家习以为常的最基本的技术,你就有可能获诺贝尔奖。

Q & A 应该没有问题吧。我下去了。

19世纪50年代,Khorana合成了寡聚核苷酸,同时,他利用合成的寡聚核苷酸DNA合成酶以及DNA,开发出了使DNA扩增的方法。当时,这一领域的研究人员通常都使用Khorana的DNA扩增技术。可以说,这是一个司空见惯的基本技术,谁也没有去想过这种方法的不便之处。

1971年,Khorana曾提出:经过DNA变性,与合适引物杂交,用DNA聚合酶延伸引物,并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。

因此,30年来没有人去改革这个方法,人人都满足于这个方法。就连Mullis本人在大学做基础研究时,也没有想到要去开发一种更简便的方法,以取代Khorana的方法。

1979年,穆利斯进入Cetus公司,从事合成寡聚核苷酸的工作。1981年他担任DNA合成实验室主任,主要任务是加速和优化寡聚核苷酸的合成。80年代初DNA合成仪进入实验室,他对这台原型机提出了许多改进的意见,还试着编写新的程序。由于DNA合成仪的应用使寡核苷酸的合成效率提高10倍。这样,穆利斯能把更多的时间用于计算机上。PCR的点子,也就是在这样的情况下诞生的。

1983年4月一个周末的晚上,他驾车与一位同事去乡村别墅在蜿蜒的乡间公路上开着车,,他思绪不断,一段DNA反复复制的景像,在他的脑海里冒了出来。他萌发了PCR的构想。

整个周末他都在思考着PCR问题,他想DNA合成起始于DNA解链,在一段寡核苷酸作为引物下,聚合酶沿着模板从引物的末端开始进行DNA的扩增,这需要人工加入核苷酸,这一过程在实验室可以实施。他还反复思考能否用两个引物来代替现行的单引物法?如果两个引物的大小不同,结果两条链的序列将同时被测定,而且互为印证;其次,他想能否分两次加入聚合酶,以防止新合成DNA的核苷酸易于脱落和被聚合酶错搭到新生链中的现象。

再有,经常使用计算机使他注意到了“循环”,他也想到DNA呈指数增长的趋势;最后他还想到扩增是否具有专一性的问题,因为在合成第一次反应中,人们无法终止聚合酶对引物的扩延。但穆利斯注意到在第二次及后续的链反应中,由第一次反应得到的那些“长反应产物”只能被扩延到另一引物与模板DNA相结合的部位,过了那个位点,扩延反应就无法进行了(没有模板)。所以PCR产物的长度是确定的。

他开始用人类神经生长因子作为目标序列进行扩增,没有结果。转而他选择PBR322质粒作为模板,实验中通过缩小反应体积来增加各成分的浓度,并将复性温度降低到32℃,减少每次加入的聚合酶的量,在10次循环后停止,结果他看到一条浅的带。接着,他又对方法进行了改进,增加几次循环,得到的带还是较浅。他又尝试用50kb碱基对的λ噬菌体做模板,用限制酶将模板降解为2000碱基对左右,扩增没有成功。他再次更换模板改用实验室合成的100碱基对的寡核苷酸作模板,对ß珠蛋白基因进行扩增,结果得到扩增产物。这期间Cetus公司成立了PCR小组,经全体成员的共同努力,1984年11月,终于得到与预期分子完全符合的扩增量,首次取得可信的结果,证明了PCR的可行。

Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段,其缺点是:①Klenow酶不耐高温,90℃会变性失活,每次循环都要重新加。②引物链延伸反应在37℃下进行,容易发生模板和引物之间的碱基错配,其PCR产物特异性较差,合成的DNA片段不均一。此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点,但由于Klenow酶不耐热,在DNA模板进行热变性时,会导致此酶钝化,每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期,给PCR技术操作程序添了不少困难。

这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的重视。1988年初,Keohanog改用T4DNA聚合酶进行PCR,其扩增的DNA片段很均一,真实性较高,只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次,仍需加入新酶。1988年,Cetus公司的Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶,此酶最大特点是耐高温,不需每次加入,大大提高了扩增片段特异性和扩增效率。此酶被命名为TaqDNA聚合酶。此酶的发现使PCR广泛的被应用。

原理简介: PCR 技术的基本原理是DNA的半保留复制。由于DNA复制是半保留的,两条链都可以作为模板。在体内,DNA复制是周期性的,所以基因扩增的数量有限;PCR技术在体外利用人工合成的引物,再加上DNA聚合酶和一些合适的底物和因子,通过对温度的控制,使DNA不断位于变性、复性和合成的循环中,达到扩增DNA的目的。