第三章 酶蛋白的化学修饰

概 念 指通过化学基团的引入或去除，使（蛋白质的）共价结构发生改变，均称为（蛋白质的）化学修饰。

第一节 化学修饰的原理 影响酶蛋白化学修饰的因素： 蛋白质功能基的反应性 修饰剂的反应性

一、影响酶蛋白功能基反应性的因素 1. 微区的极性 2. 氢键效应 3. 静电效应 4. 位阻效应

二、酶蛋白功能基的超反应性 影响超反应性的因素： 1. 蛋白质功能基的pK值 2. 蛋白质功能基的亲核性 3. 静电相互作用 4. 试剂与修饰部位的立体化学适应性 5. 试剂的结合

三、影响修饰剂反应性的因素 1. 选择吸附 2.静电相互作用 3.位阻效应 4.催化因素 5.局部环境的极性

第二节 化学修饰的方法学 蛋白质修饰时，需选择合适的修饰试剂和修饰条件

一、修饰反应专一性的控制 1. 试剂的选择 2.反应条件的选择 3.反应的专一性 （1）利用蛋白质分子中某些基团的特殊性 （2）选择不同的反应pH （3）利用某些产物的不稳定性 （4）亲和标记 （5）差别标记

亲和标记 指亲和试剂只与作用部位的特定基团发 生作用，而不与作用部位以外的其它基团发 生作用。

二、修饰程度和修饰部位的测定 1. 分析方法 用光谱法追踪检测：简便，实用，但要求修饰后 2.化学修饰数据的分析 的衍生物具有独特的光谱。 用间接法：蛋白质经降解和氨基酸分析后鉴定修 饰部位，测定反应条件。 2.化学修饰数据的分析 （1）化学修饰的时间进程分析 （2）确定必需基团的性质和数目

三、化学修饰结果的解释 1.蛋白质功能改变的解释 2.修饰残基的不稳定性 3.没有被发现的修饰

第三节 酶蛋白侧链的修饰 蛋白质侧链上的功能基主要有： 基、甲硫基。 修饰反应主要有： 芳香环取代反应等类型 第三节 酶蛋白侧链的修饰 蛋白质侧链上的功能基主要有： 氨基、羧基、巯基、咪唑基、酚基、吲哚基、胍 基、甲硫基。 修饰反应主要有： 酰化反应、烷基化反应、氧化和还原反应、 芳香环取代反应等类型

一、羧基的化学修饰 用水溶性的碳二亚胺修饰

二、氨基的化学修饰 氨基的烷基化 用三硝基苯磺酸（TNBS)修饰，在420nm 和367nm有特定的光吸收。 磷酸吡哆醛（PLP)是一种非常专一的赖氨 酸修饰剂，它与赖氨酸残基反应形成希夫碱 后再用硼氢化钠还原，其衍生物在325nm有 最大的光吸收。

二、氨基的化学修饰 在蛋白质序列分析中氨基的化学修饰最常 用的有2，4－二硝基氟苯法（DNFB，又称 sanger试剂)，丹磺酰氯（DNS)法等。 另外，氨基还可用乙酸酐、碘代乙酸、酮 类修饰。

三、精氨酸胍基的修饰 具有两个临位羰基的化合物，如丁二酮、1，2－环己二酮和苯乙二醛是修饰精氨酸残基的重要试剂。

四、巯基的化学修饰 5，5－二硫代－双（2－硝基苯甲酸） （DTMB,Ellman试剂）是最常用的巯基修饰 剂，它与巯基反应形成二硫键，释放出1个 2－硝基－5－硫苯甲酸阴离子，此阴离子在 412nm有最大光吸收。该试剂是当前定量酶 分子中巯基数目的最常用试剂。它还用于研 究蛋白质的构象变化。

四、巯基的化学修饰 有机汞试剂，如对氯汞苯甲酸对巯基专一 性很强，修饰产物在250nm有最大光吸收。 N－乙基马来酰亚胺是一种反应专一性很强 烷基化试剂也是一种重要的巯基修饰剂， 修饰产物稳定，易于分析。

五、组氨酸咪唑基的修饰 常用的修饰剂有焦碳酸二乙酯（DPC)和碘 代乙酸， DPC对组氨酸残基有较好的专一 性，产物在240nm有最大光吸收。

六、色氨酸吲哚基的修饰 N－溴代琥珀酰亚胺（NBS)可以修饰吲哚 基，并通过280nm光吸收的减少跟踪反应。 2－羟基－5－硝基苄溴（HNBB)和4－硝基 苯硫氯对吲哚基修饰比较专一。

七、酪氨酸残基和脂肪族羟基的修饰 酪氨酸残基的修饰包括酚羟基的修饰和芳 香环上的取代修饰。苏氨酸和丝氨酸残基的 羟基一般都可以被修饰酚羟基的修饰剂修 饰，但是反应条件比修饰酚羟基严格些，生 成的产物也比酚羟基修饰形成的产物更稳 定。

八、甲硫氨酸甲硫基的修饰 虽然甲硫氨酸残基极性较弱，在温和条件 下，很难选择性修饰。但是由于硫醚的硫原 子具有亲核性，所以可用过氧化氢、过甲酸 等氧化成甲硫氨酸亚砜。用碘乙酰胺等卤化 烷基酰胺使甲硫氨酸烷基化。

第四节 酶的亲和修饰 亲和标记：指亲和试剂只与作用部位的特 定基团发生作用，而不与作用部位以外的同 类或其它基团发生作用。 第四节 酶的亲和修饰 亲和标记：指亲和试剂只与作用部位的特 定基团发生作用，而不与作用部位以外的同 类或其它基团发生作用。 特点：修饰剂与底物具有相似的结构，对 酶活性部位具有高度的亲和性，能对活性部 位的氨基酸残基进行共价标记。

第五节 酶的化学交联修饰 交联剂是具有两个反应活性部位的双功能 基团在相隔较近的两个氨基酸残基之间，或 酶与其它分子之间发生交联反应。

交联剂类型 同型双功能试剂：两端具有相同的活性反 应基团，如双亚氨酯、二硝基氟苯。 异型双功能试剂：两端与不同基团作用 可被光活化试剂：一端与酶反应，另一端 经光照后产生一个活性反应基团。

第六节 酶化学修饰的应用 酶化学修饰后，会产生各种各样的变化： 酶的稳定性增强，但酶的活性一般有所降 低；针对特异性的反应降低了生物识别能 第六节 酶化学修饰的应用 酶化学修饰后，会产生各种各样的变化： 酶的稳定性增强，但酶的活性一般有所降 低；针对特异性的反应降低了生物识别能 力，解除了免疫原性，半衰期延长；产生了 新的催化能力；提高了在有机溶剂中的溶解 度。

一、化学修饰在酶的结构与功能研究中的应用 1. 研究酶的空间结构 2. 确定氨基酸残基的功能 3. 测定酶分子中某种氨基酸的数量

二、化学修饰酶在医药和生物技术中的应用 1. 酶的表面化学修饰： 可溶性大分子，如聚乙二醇（PEG)、单甲 1. 酶的表面化学修饰： 可溶性大分子，如聚乙二醇（PEG)、单甲 氧聚乙二醇（MPEG)、聚丙烯酸（PAA)、聚 氨基酸、葡聚糖、环糊精、羧甲基纤维素、 肝素等可通过共价键连于酶分子表面而进行 化学修饰。

（1）PEG和MPEG的化学修饰 使用PEG(MPEG)修饰酶，由于 PEG(MPEG)既溶于水，又溶于有机溶剂（是 两相催化剂），其免疫原性低且无毒性，含 有两个羟基有利于化学修饰，用PEG(MPEG) 修饰酶后，酶的稳定性增强，免疫原性与毒 性降低，半衰期延长，在体内的停留时间延 长，从而提高疗效 。

①MPEG均三嗪类衍生物 这类修饰剂包括MPEG1 和MPEG2，MPEG的羟基与均三嗪即三聚氯氰的氯反应，控制不同反应条件，可以分别制得活化的MPEGl和MPEG2。被三聚氯氰活化的修饰剂引入了活泼的氯，可以与酶的氨基反应。

②MPEG的琥珀酰亚胺类衍生物 MPEG琥珀酰亚胺琥珀酸酯(SSMPEG)． MPEG琥珀酰亚胺琥珀酰胺(SSAMPEG)，MPEG琥珀酰亚胺碳酸酯(SC—MPEG)等MPEG的琥珀酰亚胺类衍生物可以在PH7－10范围内修饰酶的氨基。

PEG(MPEG)修饰SOD 用PEG(MPEG)修饰SOD，可使其活力保持51％，但其稳定性明显增强，免疫原性与毒性降低，半衰期延长，更有效的发挥SOD 的功效 。

PEG修饰L－天冬酰胺酶 L－天冬酰胺酶具有较强的抗肿瘤作用，它能将肿瘤细胞生长所需的L－天冬酰胺水解为天冬氨酸和氨，从而特异并有效地抑制肿瘤细胞的恶性生长。但由于来源于微生物，是一种外源性的蛋白质，有较强的免疫原性，临床上常见有进行性免疫反应和全身性免疫反应而限制了其临床应用。用PEG修饰后，不仅可降低或消除酶的抗原性，而且可以提高酶的抗蛋白质水解的能力，延长酶在体内的半衰期，提高药效。美国FDA已于1994年正式批准用于治疗急性淋巴性白血病的培门冬酶即为L－天冬酰胺酶的聚乙二醇螯合物。

PEG修饰精氨酸酶 精氨酸酶具有抗癌作用，它用PEG修饰后，修饰率为53％时，酶活力保持在65％，与抗体结合能力和诱导产生新抗体的能力均消失，在血液中停留时间延长，显著地延长了移植肝癌后的小鼠生命。

PEG修饰尿酸酶 尿酸酶用于痛风和高尿酸血症的治疗，但尿酸酶作为异体蛋白质有抗原性，通过PEG修饰后，尿酶活力保持45％，抗原性完全消失，还延长了酶活力在血液中的保持时间。

用MPEG修饰辣根过氧化物酶 酶的化学修饰被认为是寻找新型的生物催化剂的一个有效的工具。如辣根过氧化物酶用MPEG共价修饰后，在极端pH条件下抗变性能力提高，耐热性也有所增加。

右旋糖酐修饰酶 用右旋糖酐修饰α－淀粉酶、β—淀粉酶、胰蛋白酶和过氧化氢酶有效地提高了酶的热稳定性， α—淀粉酶在65℃的t½大约是2.5min,修饰酶在65℃的t½增加到63min；。 α－淀粉酶在60℃的t½是3.5min，用右旋糖酐修饰后增加到175min。

右旋糖酐修饰胰蛋白酶 用右旋糖酐修饰胰蛋白酶，不仅增加了热稳定性，而且也使自动水解作用降低。该酶经右旋糖酐修饰后在pH8．1，37℃保温2h，酶活力没有丧失，而未修饰酶则丧失85％的酶活力。

化学修饰酶热稳定性提高的原因 化学修饰酶热稳定性提高的原因可能是由于修饰剂共价连接于酶分子后，使酶天然构象产生一定的“刚性”，不易伸展失活，并减少了酶分子内部基团的热振动。这种稳定化效果还与酶和修饰剂之间交联点的数目有关。

(2) 小分子修饰 利用小分子化合物对酶的活性部位或活性部位之外的侧链基团进行化学修饰，以改变酶学性质。 (2) 小分子修饰 利用小分子化合物对酶的活性部位或活性部位之外的侧链基团进行化学修饰，以改变酶学性质。 已被广泛应用的小分子化合物主要有氨基葡萄糖、乙酸酐、硬脂酸、邻苯二酸酐、乙酸—N—丁二酯亚胺酯等。

(3) 交联修饰 使用双功能基团试剂如戊二醛、PEG等将酶蛋白分子之间、亚基之间或分子内不同败肽链部分间进行共价交联．可使酶分子活性结构加固．井可提高其稳定性，增加了酶在非水溶液中的使用价值。

(4) 固定化修饰 通过酶表面的酸性或碱性残基，将酶共价 连接到惰性载体上后，由于酶所处的微环境 的改变，会使酶的性质(最适pH、最适温度、 (4) 固定化修饰 通过酶表面的酸性或碱性残基，将酶共价 连接到惰性载体上后，由于酶所处的微环境 的改变，会使酶的性质(最适pH、最适温度、 稳定性等)，特别是动力学性质发生改变。 如固定在带电载体上的酶，由于介质中的 质子靠近载体并与载体上的电荷发生作用， 结果使酶的最适pH向碱性(阴离子载体)或酸 性(阳离子载体)方向移动