（‘863’计划生物领域病毒基因载体研发基地） 病毒载体研究进展 吴小兵 （‘863’计划生物领域病毒基因载体研发基地） 基因载体系统 病毒载体系统 非病毒载体系统 反转录病毒载体 腺病毒载体 腺伴随病毒载体 单纯疱疹病毒载体 慢病毒载体 裸DNA DNA-阳离子脂质复合物 DNA-蛋白质复合物 DNA-阳离子多聚物 DNA/RNA嵌合物 细胞内包装 细胞外包装

要求：1、携带外源基因并能包装成感染性病毒颗粒 病毒载体概述（1） 要求：1、携带外源基因并能包装成感染性病毒颗粒 2、介导外源基因转移和表达 3、对机体不致病 容量：自身基因组大小的105%~110% 类型：1、重组型病毒载体 2、无病毒基因的病毒载体 复制缺陷型 可复制型 复制缺陷型 组成：1、病毒复制和包装元件 2、病毒基因 3、插入的外源基因或元件 4、病毒外壳/外膜 用途：基因转移和表达 1、基因治疗 2、疫苗 3、器官移植 4、组织工程 5、转基因动物 6、基因功能研究

优点：1、利用病毒天然的感染性进入细胞，转导效率高； 病毒载体概述（2） 优点：1、利用病毒天然的感染性进入细胞，转导效率高； 2、复杂的装配过程由细胞完成； 3、不同的病毒载体具有不同的表达特点。 存在的问题：1、安全性 2、靶向性 3、有效性 细胞毒性 染色体毒性 免疫毒性 转导靶向性 转录靶向性 转导效率 靶向性 基因表达水平和持续时间 表达的可调控性

常用的病毒载体的特点：

病毒载体研究方向 1、病毒包装系统 2、无病毒基因的病毒载体 3、靶向性病毒载体 4、可调控表达的病毒载体 5、嵌合型病毒载体 6、自我扩增型病毒载体 7、条件增殖型病毒载体 8、新病毒载体

病毒载体包装系统 组成：1、宿主细胞 2、辅助元件（辅助质粒、辅助病毒） 3、被包装的DNA/RNA 包含顺式作用元件 单因素生产系统（one-component system) gag pol env LTR  图1 反转录病毒包装系统示意图 双因素生产系统 (two-component system) Ad Shuttle 293 cell 293 cell E1a,b E1a,b JM17 图2 腺病毒包装系统示意图

多因素生产系统 (multi-component system) host cell Helper virus Helper plasmid rep cap Vector plasmid 图3 腺病毒伴随病毒包装系统示意图 多因素系统 双因素系统 Helper virus +helper plasmid Host cell +vector DNA rep cap Recombinant helper virus (rHSV-repcap) proviral cell 图4 双因素系统生产重组AAV病毒示意图

无病毒基因的病毒载体 腺伴随病毒载体： 反转录病毒载体： 腺病毒载体： 单纯疱疹病毒载体： 被包装的DNA/RNA中不含任何病毒编码基因，只保留其复制和 包装所必需的顺式作用元件。获得的重组病毒颗粒具有野生型病 毒的外壳/外膜和感染性，但不表达病毒蛋白。 腺伴随病毒载体： gene ITR pA 反转录病毒载体： LTR  gene 腺病毒载体： ITR ITR gene pA 单纯疱疹病毒载体： gene pac ori

Adenovirus with packaging 无辅助病毒包装系统 adenovirus gene ITR aav vector plasmid E2a E4orf6 VA Helper plasmid: 293细胞 E1a,b 图5 重组AAV无辅毒包装系统 gene ITR cre 293-cre Adenovirus with packaging signal flanked by loxP 图6 mini-adnovirus无辅毒包装系统

靶向性病毒载体 cell 转导靶向性 改造病毒外壳/外膜 连接靶向性结合分子 转录靶向性（特异性） 组织特异性启动子 肿瘤选择性启动子 Modified adenovirus 转录靶向性（特异性） 组织特异性启动子 肿瘤选择性启动子 细胞周期调控启动子 肿瘤血管内皮导向启动子 双特异性启动子 病毒增殖的特异性转录调控

可调控表达的病毒载体 细胞特异性转录 细胞启动子 病毒启动子 细胞的调控元件 病毒的调控元件 人工合成的调控元件 四环素调控 合成的转录因子 P1 tTA tetOp gene 细胞启动子 病毒启动子 albumin MVM P4 Tyrosinase or TRP-1 B19 promoter PSA HBV MBP JCV MCK EBV GFAP NSE KDR/flt-1 AFP CEA erbB2 HRE MDR1 合成的转录因子 GAL4 ER VP16 ESTRADIOL RXR EcR VP16 RU486 muristerone GAL4 PR VP16 ZFHD-1 FKB12 FRAP P65 Diphenol indene rapamycin GAL4 ER p65

重组病毒的生产和纯化 大量制备和纯化 小量制备和纯化 实验室 中试车间 培养瓶 转瓶、细胞工厂、发酵罐 反复冻融 机械法或化学法裂解 场所 细胞培养 细胞裂解 病毒分离 病毒纯化 制剂 保存 实验室 中试车间 培养瓶 转瓶、细胞工厂、发酵罐 反复冻融 机械法或化学法裂解 离心 离心、超滤、萃取 密度梯度超速离心 浓缩、柱层析 缓冲液 配方 低温

病毒载体与基因治疗产业化 基因治疗的三个核心部分 基因治疗产品的知识产权构成 产业化的组织和实施： 1、基因载体系统 2、基因表达系统 3、治疗基因 基因治疗产品的知识产权构成 1、治疗基因 2、调控元件 3、改造的外壳/外膜 4、靶向分子 5、包装系统 6、生产和纯化技术 7、制剂和保存技术 产业化的组织和实施： 1、合作开发 2、专业分工 3、政府支持和企业投资 4、利益分配

基因治疗领域的知识产权主要通过专利系统来保护 知识产权和基础研究 基因治疗领域的知识产权主要通过专利系统来保护 对于基因治疗公司最重要的专利是： 1、载体系统； 2、生产过程；3、整体治疗方案 治疗基因和表达系统可以从其它方购买使用权。 专利对学术研究的影响 1、无影响（对非常早期研究） 2、有影响（对临床试验和可能的商业开发） 政府支持对基因治疗产业化的重要作用 1、政策上促进基因治疗的科研、临床和商业开发 2、资助基因治疗核心技术研究和开发 3、资助建立能规模化生产临床级基因载体的中心或基地 4、支持从事基因治疗的公司发展新技术、新产品 5、促进新的基因治疗公司建立。 6、制定规范、高效且符合国情的审批程序。