显色指示片：1张/人，一次性纸杯1个/人，纯净水全班共用 1.真菌形态观察 酵母菌溶液1份（共用） 示教片4张/班、玻片3张/人 2.口腔微生物观察 玻片2张/人 3.牙菌斑生物膜检测 显色指示片：1张/人，一次性纸杯1个/人，纯净水全班共用

实验四 一. 真菌形态观察 二. 口腔微生物观察 三. 牙菌斑生物膜检测

一、真菌形态观察 （一）目的 观察单细胞和多细胞真菌形态

多细胞真菌 单细胞真菌

1. 菌种 单细胞真菌-酵母菌 多细胞真菌-曲霉示教片（4张/班） 霉菌平板 2. 染液 石碳酸复红（ 革兰染液之复染液） 3 1.菌种 单细胞真菌-酵母菌 多细胞真菌-曲霉示教片（4张/班） 霉菌平板 2.染液 石碳酸复红（ 革兰染液之复染液） 3.其他 盖玻片、透明胶带、载玻片、酒精灯等 （二）材料

（三）染色方法-酵母菌染色（石炭酸复红染色） 1.标记：取一洁净载玻片，在玻片透明区正中央画一 直径约1cm的涂片区,反扣玻片，用另一面涂片。 2.涂片：将棉签放入酵母菌稀释液中浸湿后在杯壁 上挤去多余的液体后，直接用棉签在涂片区 涂片。 3.干燥：方法同革兰染色。 4.直接镜检： 用高倍镜观察镜下形态。 5.染色：加1-2滴石碳酸复红染液覆盖标本，染色30s 冲洗，用吸水本吸干玻片上残余的水渍。 6.观察：于显微镜高倍镜及油镜下观察真菌形态。

酵母菌 1000倍

（四）多细胞真菌-曲霉（示教） 曲霉菌 400倍 曲霉菌 100倍 于显微镜高倍镜观察其菌丝和孢子形态。

（四）多细胞真菌-不染色观察 1.直接镜检：将长有真菌的平板直接放在显微镜下用低倍镜观察菌丝和孢子。 2.涂片检查：取棉兰染液1滴于玻片上，用接种环取少量真菌的菌丝于棉兰中混匀，盖上血盖片，尽量不要产生气泡，低倍镜或高倍镜下观察菌丝和孢子。 3.胶带法镜检：取一小段透明胶带，粘取少量霉菌菌落贴在玻片上，低倍镜或高倍镜下观察菌丝和孢子。

二、口腔微生物观察 （一）目的 了解口腔微生物的种类

口腔为人体四大“菌库”之一。 口腔为机体正常微生物定植的最佳生态区。 温度：36.5～37 ℃ 湿度：适宜 pH：5.4 ～ 7.0 营养：丰富的营养源。

口腔微生物是人类最早发现的微生物。 细菌学之父 Antony van Leeuwenhoek ( 1632-1723 ）在 1679 年用自制的显微镜观察到牙垢上的各种球形、 杆状和螺旋形的“小动物”，这就是我们现在认识的球菌、 杆菌和螺旋体。 口腔微生物群 13

口腔微生物群 细 菌 真 菌 病 毒 原 虫 目前有关口腔微生物分布的研究主要是细菌，其次是真菌，对病毒、支原体和原虫等口腔微生物分布的文献鲜见。 14

来源:父母或亲密接触的人 研究者们在剖腹产的新生儿口腔 中未检查出细菌，由此认为人出生 时口腔一般是无菌的。 在一项出生 1～2 天的新生儿口腔菌群调查中发现，在新生儿口腔中检出与母亲口腔中相同血清型的唾液链球菌 。 一项对父子（女）或母子（女）口腔内中间普雷沃菌的检测，也发现了相同血清型的中间普雷沃菌在父子（女）或母子（女）口腔中存在。 16

以上这些研究结果 均提示了细菌来源于新生儿的母亲或密切接触的人，以及口腔细菌在亲属或家庭中流行 或传播的可能性。 唾液链球菌是新生儿口腔中最早定植的链球菌菌种， 98%以上的新生儿在出生后 1～2 天，即可从口腔中分离到唾液链球菌。

（二）材料 1.菌种 自取：无菌棉签自取口腔标本获得 2.试剂 革兰染液 抗酸染液 3.其它材料 无菌棉签，载玻片，染色盘，染色架，洗液瓶，酒精灯 等。

（三）口腔微生物观察方法 1.细菌涂片的制备 涂片 干燥 固定 涂片： 1）画涂片区：同革兰染色； 2）取1滴生理盐水于涂片区； 涂片 干燥 固定 涂片： 1）画涂片区：同革兰染色； 2）取1滴生理盐水于涂片区； 3）如图将无菌棉签放入口腔，唾液湿润棉签后擦 取内表面牙垢附近取样，之后立即与涂片区生 理盐水混合制成细菌涂片。 干燥和固定方法同革兰染色

（四）口腔微生物观察方法 2.革兰染色 ①龙胆紫液 ②碘液 ③脱色液 ④沙黄溶液复染 吸水纸吸干 ①龙胆紫液 ②碘液 ③脱色液 ④沙黄溶液复染 吸水纸吸干 10s 10~20s 10s 冲洗，甩干 冲洗，甩干 冲洗，甩干 10s 冲洗 染色完成之后，在涂片区滴上香柏油使用油镜观察实验结果

3.抗酸染色 (1)细菌涂片的制备（取样同革兰染色） (2)染色 （3） 用油镜观察 涂片 干燥 固定 (2)染色 1）初染：用玻片夹夹持涂片标本，滴加石炭酸复红2-3 滴，在火焰高处（2-10cm）徐徐加热，切勿沸腾，出现蒸汽即暂时离开，加热3～5min，若染液蒸发减少，应再加染液，以免干涸，待标本冷却后用水冲洗。 2）脱色： 3%盐酸酒精脱色30s～1min；用水冲洗。 3）复染：用碱性美兰溶液复染1min；用水冲洗后用吸水纸吸干。 （3） 用油镜观察

口腔上皮细胞和细菌 1000倍

三、牙菌斑生物膜检测 （一）目的 了解牙菌斑生物膜的概念 了解牙菌斑检测的意义

（二）牙菌斑生物膜简介 1.牙菌斑生物膜（dental plaque biofilm) 是黏附于牙面、口内修复体和矫治器表面由微生物及 胞外多聚物（extracellular polymeric substance, EPS）等 组成的，软而未矿化，与口腔感染性疾病密切相关的，有 高度组织化和系统化的膜性聚合物。

黏附力强，不易被水冲去或漱掉。 胞外物质基本成分：水、蛋白质、多糖、脂质和无机物等。 2.特点 25

3.牙菌斑生物膜的形成和发展分3个阶段 （1）获得性薄膜的形成 作用 促进早期菌黏附定植及细菌共聚。 由唾液蛋白或糖蛋白选择性吸附至牙面， 形成一层无细胞、无结构的薄膜 。 作用 促进早期菌黏附定植及细菌共聚。 为细菌提供营养物质和代谢基质。 有利于牙面的矿化或再矿化（因膜中蛋白质、氨 基酸可结合钙、磷、氟等矿物质）。 保护牙釉质：减少牙釉质对酸的敏感性。

细菌黏附和共聚是牙菌斑形成和成熟的必要条件。 3.牙菌斑生物膜的形成和发展分3个阶段 （2）细菌的黏附 细菌黏附和共聚是牙菌斑形成和成熟的必要条件。 黏附是一个复杂的过程，机制尚未完全清楚。如：钙桥作用、氢键作用、疏水作用和受体-粘附素作用等等。 27

3.牙菌斑生物膜的形成和发展分3个阶段 （3）牙菌斑的成熟 成熟是一个动态变化过程。 菌斑成熟的重要特征是细菌组成的变异性大。 成熟过程中细菌的组成和比例，菌斑的结构都在不断变化，以适应环境的改变，最终发育成熟。早期菌斑结构疏松，兼性厌氧菌为主，随后逐渐致密，后期厌氧菌多。12小时可由菌斑染色剂显示，9天形成各种细菌的复杂生态群体，10~30 天菌斑发育成熟达到高峰。 菌斑的形成至少要6个小时。

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牙石是由附着于牙齿表面的菌斑和其他沉积物 如软垢等钙化而成。 牙菌斑肉眼可见吗？ 牙菌斑=牙石？ 牙石是由附着于牙齿表面的菌斑和其他沉积物 如软垢等钙化而成。 30

1.试剂 牙菌斑显示片 （由可食用的 植物染料制成） 2.其它材料 无菌棉签， 纸杯，纯净水等。 （三）材料

（四）牙菌斑检测方法 1.漱口：用一次性纸杯取纯净水漱口数次，去除食物 残渣。 2.咀嚼显示片：取1片牙菌斑显示片放入口中,充分咀 嚼（勿咽），再用舌尖舔至牙面内外两侧。 3.漱口：30秒后吐出残余物并漱口。 4.结果：对镜检查（手机自拍），牙面被染成红色的部分即牙菌斑附着的部位。 注意：操作和使用过程中勿污染衣服

（五）结果 显影结果 注：刷牙可去除牙面残留颜色，牙菌斑显示片也会染红舌和牙龈，但不会持续很长时间。

（六）牙菌斑生物膜检测意义 牙菌斑为龋病和牙周病的主要病因之一。 1.用于口腔卫生教育。 2.检查口腔卫生状态。 3.辅助去除牙菌斑。 4.辅助指导刷牙（针对特别需要注意的牙面）和 提高刷牙效果。 播放牙刷选择及正确刷牙方法视屏

下周实验内容 病毒的接种技术 实验考试