实验材料 1.肠道致病菌的鉴定： 玻片每人2张； 革兰染液； 沙门菌属多价O血清（1套/班）； 双糖铁培养基（2支/组，18支/室）； 大肠，伤寒，痢疾三种细菌在双糖铁培养基上的生长现象 示教（每个教室1组）。 2.药敏实验： 菌液（1个/组，8个/室）。 固体平板（2个平板/组，19个/室）； 药敏纸片（1套/班）。 药敏实验的示教板（1个/室，共8个）。 3.内毒素的检测（2人/组，2支鲎试剂，共38支鲎试剂/室）

实 验 三 三、肠道杆菌的鉴定 二、药敏试验 一、内毒素的检测

一、内毒素的检测 目的 1.掌握内毒素实验的原理和操作方法。 2.熟悉内毒素实验的意义。

检测方法 家兔发热法：比较烦琐，且灵敏度不高； 鲎实验法：灵敏度高，可检测小于10ng/ml 的内毒素。

鲎 horseshoe crab

凝固酶 凝固酶原 激活 原理： 鲎是一种海洋节肢动物，其血液中含有一种有核变形细 胞，这种细胞的胞浆中含有凝固酶原和凝固蛋白原。 内毒素（LPS） 激活 凝固蛋白原 凝固蛋白 （溶解状态） （凝胶状态） 凝固酶原 凝固酶

材料： 鲎试剂 内毒素试剂 鲎试剂专用溶解水 无菌无热源质吸管

垂直放入37℃温箱，20-30分钟观察结果。 方法：（每四人两支鲎试剂，一支实验一支对照） 0.2ml溶解水 结果： 对 照 实 验 0.1ml溶解水+0.1ml内毒素 0.2ml溶解水 垂直放入37℃温箱，20-30分钟观察结果。 结果： 实验组出现凝固 对照组不出现凝固

内毒素检测的应用： 1.检测输液用品或生物制品中是否含有内毒素； 2.临床上检测患者是否有革兰氏阴性菌感染引 起的内毒素血症（内毒素休克）等。

二、药 敏 试 验

目的要求 1.掌握纸片扩散法药敏试验的原理及结果判定； 2.了解药敏试验的操作方法和意义。

原 理 含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的浓度梯度。在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度。

主要实验材料 1.大肠杆菌，白色葡萄球菌培养物 2.含抗生素的滤纸片： 青霉素 氯霉素 链霉素 庆大霉素 3.普通平板，细菌接种工具，培养箱

方法步骤 1.标记分区； 2.密涂接种； 3.贴药敏纸片； 4.培养； 5.结果观察。

1.标记分区

2.密涂接种

3.贴药敏纸片

4.培养 置37℃温箱， 培养18-24h。

五、 结果 抑菌圈直径

操作内容 1.两人1个平板 2.密涂接种大肠杆菌，贴片，标记及培养

三、肠道杆菌的鉴定

病 原 菌 的 检 验 程 序 增菌培养 革兰染色 分离培养 接种琼脂斜面纯培养 采集标本 生化试验 血清学试验 动物试验 分析鉴定 观察菌落特征 病 原 菌 的 检 验 程 序

细菌的生化反应 概念：用生化的方法来检测细菌对各种基质的代谢作用及代谢产物，借以鉴别细菌种类，这种生化试验称为细菌的生化反应试验。 意义：是鉴别细菌的重要依据。

生化反应 碳水化合物 代谢试验 碳源和氮源 利用试验 蛋白质和氨基酸代谢试验 各种酶类试验： 尿素酶实验 抑菌试验 糖发酵试验 甲基红试验 V-P试验 蛋白质和氨基酸代谢试验 硫化氢试验 吲哚试验 碳源和氮源 利用试验 枸橼酸盐利用试验 IMViC试验 尿素酶实验

（一）糖发酵试验 [原理] 根据细菌分解利用糖能力的差异表现出是否产酸产气作为鉴定菌种的依据。是否产酸，可在糖发酵培养基中加入指示剂溴甲酚紫（其pH在5.2以下呈黄色，pH在6.8以上呈紫色），经培养后根据指示剂的颜色变化来判断。是否产气，可在发酵培养基中放入倒置杜氏小管观察。

微量细菌生化鉴定管

[方法] [结果] 取糖发酵管培养基，此时培养基应呈澄清、紫色，倒立小管内无气泡，接种细菌后置37℃温箱培养18－24小时，观察结果。 1、确定细菌是否生长 2、产酸，则培养基指示剂（溴甲酚紫）变为黄色，以“+”表示。 3、产酸又产气，则培养基除变黄外，在倒置的小管中有气泡，用“　　”表示。 4、不发酵糖类，培养基仍为紫色，小管内无气泡，以“-”表示。

糖发酵实验 大肠杆菌 伤寒杆菌 副伤寒杆菌 葡萄糖 + 乳糖 -

（二）IMViC试验 是一组试验 靛基质试验或称吲哚试验（I）、甲基红试验（M）、V－P试验（V）和枸橼酸盐利用试验（C）可缩写为IMViC试验，i是为了发音的需要加入的。 常用于革兰阴性的肠道细菌检测中，可区分产气杆菌属和大肠杆菌属 大肠杆菌＋＋－－；产气肠杆菌－－＋＋； 伤寒杆菌-＋－－； 痢疾杆菌-＋－－。

1. 吲哚试验 [原理] 色氨酸几乎存在于所有的蛋白质中，某些细菌含色氨酸酶，能将分解蛋白胨中的色氨酸而生成靛基质（吲哚）。后者与寇氏试剂中对二甲基氨基苯甲醛作用，形成红色。 [方法] 将大肠杆菌、产气杆菌分别接种在蛋白胨水培养基中，37℃培养24－48小时取出，在上述细菌的培养液内各加入寇氏试剂数滴，略加振摇，静止半分钟后观察结果。

[结果] 大肠杆菌为阳性 伤寒杆菌为阴性 阴性 阳性

2.甲基红试验 葡萄糖 丙酮酸 大量混合酸 乙酰甲基甲醇（中性） pH＞5.4 pH降至4.4以下 培养基橘黄色 培养基变红 大肠杆菌 甲基红试剂 甲基红试剂 培养基橘黄色 培养基变红 大肠杆菌 产气杆菌

[方法] 在大肠杆菌和产气杆菌培养物中滴加甲基红指示剂数滴，立即观察结果。 [结果] 红色为阳性，+ 不出现红色为阴性，-

3. V－P试验 葡萄糖 丙酮酸 乙酰甲基甲醇 V-P试剂 二乙酰 与蛋白胨培养基精氨酸中的胍基 反应生成红色化合物 培养基变红 产气杆菌

[方法] 取出试管培养物，加入等量的李氏试剂，摇匀后不加塞，静置30分钟观察结果。 [结果] 红色为阳性，+ 无红色为阴性，-

4. 枸橼酸盐利用试验 培养基 枸橼酸盐 铵盐 碳酸盐 氨 培养基pH上升 溴麝香草酚蓝 呈碱性变色 培养基变蓝 产气杆菌

[结果] 深蓝色为阳性+ 绿色为阴性-

（三）硫化氢产生试验 [原理] 某些细菌能分解蛋白质中的含硫氨基酸，如半胱氨酸、甲硫氨酸，而生成硫化氢。硫化氢遇培养基中的铅盐或铁盐，形成黑色的硫化铅或硫化亚铁沉淀物。 [方法] 分别穿刺接种大肠杆菌、变形杆菌至两管醋酸铅培养基中。37℃孵育24小时后观察结果。

[结果] 沿穿刺线部位呈黑褐色， 表明有硫化氢产生，为阳性以“+”表示，不变色者为阴性，以“-”表示。 大肠杆菌：- 变形杆菌：+

二、肠道杆菌的鉴定 实验目的： 1.熟悉病原性杆菌的一般鉴定过程； 2.进一步熟练掌握革兰染色的操作； 3.学会在选择培养基中进行菌落的观察； 4.掌握肠道杆菌在双糖铁培养基上的生长 特点。

粪 便 增菌培养（必要时） 肠道杆菌的鉴定程序 SS 培养基 已完成 生化反应 报告结果 接种双糖铁 菌落特征；涂片镜检（革兰染色）； 血清学鉴定 （玻片凝集） 生化反应 报告结果

（一）观察SS培养基上细菌生长现象 SS培养基上各菌的生长特点： 大肠杆菌：粉红色大菌落 痢疾杆菌：无色细小半透明菌落 伤寒杆菌：半透明小菌落，黑色沉淀

（二）革兰染色（取ss培养基上的两种菌落的细菌染色） 1.细菌涂片的制备 涂片 干燥 固定 2.染色 初染（结晶紫） 媒染（碘液） 脱色 （丙酮乙醇） 复染（沙黄） 吸水纸吸干 10s 10s 冲洗 冲洗 10-20s 30s 冲洗 冲洗 染色完成之后，在涂片区滴上香柏油使用油镜观察实验结果

（三）双糖铁培养基（KIA）进行培养 方法：穿刺+斜面 接种针挑取单个菌落，沿培养基中心垂直插入至距离管底0.5cm处，原路退出。 接种环挑取单个菌落，自斜面底部向上划一直线，然后再从斜面底部向上轻轻来回作蜿蜒划线。 培养18-24小时，观察结果并分析。 注意：1. 应在菌落稀疏部位挑取单个菌落。 2. 穿刺和斜面接种原则上应为同一个菌落。 3. 不同的小组可以选择不同颜色的菌落来接种。

双糖铁培养基上各菌的生长特点 含有乳糖和葡萄糖：产酸产气 含有硫酸亚铁：如细菌分解含硫氨基酸生成 硫化氢，可形成黑色沉淀。 酚红指示剂： 酸 黄 碱 红 酚红的变色范围：6.8-8.0 黄-红

双糖铁培养基上各菌的生长特点 1.大肠杆菌发酵乳糖和葡萄糖产酸产气（糖发酵试验），使斜面及底层均呈黄色并有气泡。 2.沙门菌和志贺菌只发酵葡萄糖，不发酵乳糖，分解葡萄糖产的酸使培养基pH下降，酚红指示剂变黄，但是培养基中的葡萄糖仅有0.1%，在斜面的酸性物质被氧化成挥发性酸，且细菌氧化氨基酸物质产生的氨的中和作用，使斜面变红，而底层则为黄色。

双糖铁培养基上各菌的生长现象 大肠杆菌 黄色有气泡 伤寒杆菌 上红下黄中间有黑色沉淀 痢疾杆菌 上红下黄 48

（四）血清学试验-玻片凝集法 方法： 1.取清洁玻片一张，用记号笔划分成两部分。分别在两边滴加1滴沙门菌属多价血清。 2. 用接种环挑取SS平板上菌落（黑色菌落，粉红色大菌落）与血清混合研磨成均匀乳状。 3.轻轻摇动玻片，1min内观察结果。 伤寒血清+待测菌 伤寒血清+待测菌 结果: 凝集+ （伤寒杆菌）；无凝集-（大肠杆菌）

本次实验所做内容 肠道杆菌鉴定 （1）观察菌落特征（SS平板） （2）取可疑菌落做革兰染色（1张/人） （3）双糖铁培养基接种（2支/组） （4）血清学试验鉴定伤寒杆菌（1张/人） （5）观察大肠杆菌，伤寒杆菌在双糖铁培养基上的生长现象（示教）

结果判断依据 SS平板：菌落的形态，颜色； 革兰染色：形态，排列，染色特点 双糖铁培养基上生化特点 血清学试验的结果

实验报告 肠道致病菌培养后的鉴定结果以及鉴定依据。 1.SS培养基菌落特点。 2.革兰染色的结果。 3.玻片凝集的结果。 4.双糖铁的生长现象描述。 5.结论。

每个班务必带一个发霉的馒头！（班长负责） 下周实验内容 口腔微生物观察及牙菌斑检测； 真菌染色观察真菌菌落的观察； 每个班务必带一个发霉的馒头！（班长负责）