急性毒性作用及其 评价方法

定 义 急性毒性(acute toxicity)是指机体(人或试验动物)一次接触或24小时内多次接触药物后在短期(最长到14天)内所发生的毒性效应，包括一般行为、外观改变、大体形态变化以及死亡效应。 最主要观察指标是LD50

急性毒性试验的目的 ①测试和求出药物对试验动物的致死量(以LD50表示 )以及其它的急性毒性参数, 了解急性毒作用强度。 ②观察动物中毒表现和死亡情况，了解急性毒作用 性质、可能的靶器官和致死原因。 ③探求药物急性毒性的剂量-反应关系与中毒特征。 ④为多次重复给药毒性试验（亚慢性、慢性毒性作 用）的剂量设计提供参考依据。

LD50的概念 1927年由Trevan提出的一种带有置信限估 计的中介值，是反映药物毒效应的上限 指标。 定义：能引起一群实验动物50％死亡所 需的剂量，或是某药物于一次性给予一 群动物后预期引起50％死亡的经统计学 演算得出的一个剂量。

LD50测定的意义 （1）LD50是药物的重要特征性参数之一。 常被用来判断药物对机体的毒性程度，其数值 越大，说明该药物越安全。 LD50并非一个绝对的生物学常数，它与药物的 pH、pKa、熔点、凝点、比旋度、溶解度等常数 不同，LD50仅是一个统计学参数，一个为描述 药物在某个特殊的群体中以致死反应为指标而 设计的统计学术语，是许多反映药物急性毒性 的参数之一。

LD50测定的意义 （2）有助于计算其它相关毒性参数。 ①急性毒作用带（Acute adverse effect zone, Zac）是指药物的毒性上限与下限的比值。 Zac＝LD50/Limac 其中LD50代表毒性作用的上限，Limac为急性阈剂量，代表毒性作用的下限。 ② 治疗指数 (Therapeutic index，TI)是指半数致死量与半数有效量之比值。 TI=LD50/ED50

LD50测定的意义 （3）药物急性毒性分级依据。 按药物的LD50值进行相对急性毒性分级可粗略 地表示其急性毒性的强弱和对人的潜在危害程 度，这一分级标准目前尚未完全统一，WHO推 荐了一个五级分级标准。 （4）为长期毒性试验、特殊毒性试验和临床药 理评价提供剂量设计参考。 （5）为毒效应的靶器官确定和机制分析提供线 索。

6只大鼠吸入4小时，死亡2~4只的浓度(ppm) 急性毒性分级 外源化学物急性毒性分级（WHO） 毒性分级 大鼠一次经口LD50 (mg/kg) 6只大鼠吸入4小时，死亡2~4只的浓度(ppm) 兔经皮LD50(/mg/kg) 对人可能致死的估计量 g/kg 总量(g/60kg) 剧毒 <1 <10 <5 <0.05 0.1 高毒 1~ 10~ 5~ 0.05~ 3 中等毒 50~ 100~ 44~ 0.5~ 30 低毒 500~ 1000~ 350~ 250 实际无毒 5000~ 10000~ 2180~ >15 >1000

急性毒性分级 我国食品毒理急性毒性分级法 急性毒性分级 大鼠经口LD50 (mg/kg) 大致相当于70kg人 的致死量 6级(极毒) <1 稍尝,<7滴 5级(剧毒) 1~50 7滴~1茶匙 4级(中等毒) 51~500 1茶匙~35克 3级(低毒) 501~5000 35~350克 2级(实际无毒) 5001~15000 350~1050克 1级(无毒) >15000 >1050克

非致死性毒性反应及其转归 外源化合物可对机体的生理、生化、免疫、神经或其它系统产生损害，使正常生理功能发生严重紊乱，有些实验动物虽可幸免于致死性毒效应，但可能出现上述系统不可逆的损伤，即产生非致死性毒性反应。 非致死性有害反应与致死性反应仅仅是程度上的差异，都是用药过程中不希望出现的。

非致死性毒性反应及其转归 非致死性反应的转归问题主要涉及到反应是否可逆。可逆反应是指当药物在体内消除后，反应也亦随之消失，不残留任何效应。 反应的可逆与否主要取决于下列因素： 1．毒性作用涉及的器官与系统 2．药物的内在毒性 3．用药时间的长短 4．在确定的时间范围内，药物在体内的量 5．实验动物的年龄（月龄）和健康状况

急性毒性试验 一般程序: 通过一定的染毒途径给予数组实验 动物，必要时可增加一个溶媒对照组，在特 定的时间间隔内观察实验动物的行为表现、 中毒症状及死亡情况。 试验过程中对死亡动物进行大体肉眼尸检， 存活动物在实验终止时处死并进行尸检，尸 检中如发现明显的组织或器官异常，进行病 理组织学检查。

实验动物 [原则] ①急性毒性试验要求选择对化学毒物的代谢和毒效应表现与人的反应尽可能一致的试验动物。 ②动物易于获得。 ③品系纯化。 ④价格较低和易于饲养等条件。

实验动物 1．实验动物的种属和品系 最好用两种种属的动物 啮齿类: 小鼠、大鼠、豚鼠或家兔 非啮齿类：犬或猴 根据不同接触途径和试验要求，选择不同的物种 。首选大鼠或小鼠：经济；易于获得且便于饲养 和管理 ；毒理学研究背景资料较多便于比较

小鼠则以昆明种、NIH、ICR为多

急性毒性试验所用大鼠的品系以SD、Wistar为主

实验动物的选择 研究内容 实验动物 急性毒性 大、小鼠 免疫毒性 大、小鼠、最常用C57BL/6 放射病 狗、大、小鼠，不用兔 研究内容 实验动物 急性毒性 大、小鼠 免疫毒性 大、小鼠、最常用C57BL/6 放射病 狗、大、小鼠，不用兔 吸入性粉尘 大鼠 药物对皮肤局部作用 兔、豚鼠 实质性脏器的毒作用 小鼠 慢性毒性 大鼠、狗 致畸性 大、小鼠、兔 致突变性、致癌性 大、小鼠

实验动物 ⒉实验动物的年龄和体重： 急性试验动物不宜过老或过幼，通常要求选择刚成 年动物进行试验，而且须是未曾交配和受孕的动物 。例如：大鼠180～220g、小鼠18～22g、家兔2～ 2.5kg、豚鼠200～250g、狗10～15kg。 同一批试验动物体重变异范围不应超过该批动物平均体重的20％。

实验动物 3.实验动物的性别： 除特殊要求外，一般为雌雄各半(数目相等)。 如果在预试验时发现药物对雌、雄动物毒效应的敏感性有明显差异，则应单独分别求出雌性与雄性动物各自的LD50。

实验动物 4.动物数量与随机分组： 5.禁食： 大、小鼠等小动物 每组10只 狗等大动物 每组6只 分组原则——随机化原则 大、小鼠等小动物 每组10只 狗等大动物 每组6只 分组原则——随机化原则 5.禁食： 经口给药时，要求试验前对动物禁食 大鼠、小鼠——隔夜禁食；给药后禁食4h 大动物——每日上午喂食前给药 给药后继续禁食2~4h，不禁水。

实验动物 实验动物的饲养环境 恒定的温度：25±3℃ 相对湿度：30~70% 照度：昼夜各半 饲料合格、饮水合格、垫料合格

染毒方法 染毒途径的选择需考虑：模拟人在生活和生产环境中实际接触受试物的途径和方式；有利于不同化学物之间急性毒性大小的比较；受试物的性质和用途；各种受试物毒性评价程序的要求等。 最常用的染毒途径为经口、经呼吸道、经 皮及注射途径。

染毒方法 经口(胃肠道)接触 : 灌胃:小鼠0.21.0ml/只或0.10.5ml/10g 大鼠一次灌胃体积不超过3ml/只 家兔不超过10ml/2kg 狗不超过50ml/10kg 吞咽胶囊:多用于犬、猴的给药 经呼吸道接触 : 静式吸入 动式吸入 经皮肤接触 : 目前多选用家兔和豚鼠 注射途径接触:

剂量设计 1．查阅文献 ①找出与受试化学毒物结构近似或有共性基 团的化合物的毒性资料。 ②了解化学毒物的结构式、分子量、熔点、沸 点、密度、水溶性和脂溶性等理化特性。 通过与受试化学物化学结构与理化性质近似 的化学物的毒性资料，以其LD50(LC50)值作为受 试化学物的预期毒性中值。

剂量设计 2．预试验 i=(lgLD90-lgLD10)/(n-1) 或i=(lgLD100-lgLD0)／(n-1) ②根据确定的剂量组进行染毒。 ③根据预试验的死亡资料确定组距(10%-90%动物死亡剂量范围)。 可根据以下公式计算出剂量分组： i=(lgLD90-lgLD10)/(n-1) 或i=(lgLD100-lgLD0)／(n-1) 式中i为组距，n为设计的剂量组数。

剂量设计 3．正式试验 求得i值后，以最低剂量组(LD0或LD10)的对数剂量加上一个i值 ，即是第二个剂量组的对数剂量，依此类推直至最高剂量组， 查各自的反对数即得出各组剂量的真实值。 1 2 3 4 5 6 LgLD0 LgLD0+i LgLD0+2i LgLD0+3i LgLD0+4i •••

i=(lgDmax-lgDmin)/(n-1) 剂量设计 4．全新结构的受试物 先通过少量动物的摸索找出0%和100%估计死亡值， 再求出i值。 ①先用10倍稀释的药物浓度系列，用少量动物找出大 致的死亡范围。 ②再用2倍稀释的药物浓度每组4只动物寻找。 i=(lgDmax-lgDmin)/(n-1)

剂型与给药 1. 受试物应能溶于或混悬于适当的溶媒中。 若溶媒毒性未知，应设溶媒对照组，其给药容量与最高剂量组相等。 2.给药方法：等体积或等浓度。 3.给药体积：具体根据动物种属和给药途径来 确定。

急性毒性试验常用动物单次给药的 常用容量和最大容量 给药途径 常用容量 最大容量 小鼠 ig、ip 0.2 ml/20g 1.0 ml/20g iv 0.5 ml/20g sc 0.1 ml/20g im 大鼠 1.0 ml/200g 3.0 ml/200g iv、sc 0.5 ml/200g 0.2 ml/200g 犬 ig 10 ml/只 20 ml/只 35 ml/只 50 ml/只

试验时限与量限 1. 时限 致死迅速的受试物 24h 致死较慢的受试物 3-7天(一般不超过14天) 2. 量限 口服给药 5g/kg 致死较慢的受试物 3-7天(一般不超过14天) 2. 量限 口服给药 5g/kg 注射给药 2g/kg 在此剂量下如无死亡出现，通常不必做更高的剂量。

毒效应观察 1.中毒症状 中毒部位 症状表现 中枢神经及运动神经系统 自发活动减少或增加、嗜睡、僵持、震颤、共济失调等 植物神经系统 瞳孔放大或缩小、竖毛、腺体分泌增加、竖毛等 呼吸系统 呼吸急促、缓慢、窒息、鼻孔分泌物等 心血管系统 心动过速、心动过缓、心律失常等 胃肠道系统 便秘、腹泻、呕吐等 泌尿系统 血尿、多尿等 眼睛 流泪、眼球突出、结膜炎等 皮肤、被毛 发红、皮疹、水肿等

毒效应观察 体重可以反映动物中毒后的整体变化。 2. 体重 体重可以反映动物中毒后的整体变化。 体重改变的原因很多:①刺激或损伤消化道试验动物 饮食减少甚至拒食，表现为体重减轻。②腹泻，影 响食物吸收和利用，体重也会减轻。③影响水的摄 取或肾功能急性损伤，也可能在体重上反映出来。 所以，对存活动物尤其是对低于LD50剂量组的存活 动物,应在观察期14天内称量其体重的变化,以便了 解受试物引起毒效应的持续时间。

毒效应观察 3.病理检查及其他指标 对死亡的动物均应及时进行大体解剖和病理组 织学检查，肉眼观察主要脏器的大体病理变化 ，如脏器大小、外观、色泽的变化，有无充血 、出血，对有改变的脏器取材做组织病理学检 查。 对存活动物在观察期结束时进行大体病理检查 ．必要时做组织病理学检查。根据试验需要可 进一步扩大观察项目．如体温、心电图、脑电 图或进行某些生化指标测定等。

毒效应观察 4. 死亡过程和死亡时间 观察实验动物给药后的死亡过程，有助于探讨中 毒的机制或动物中毒的死亡原因。 观察和记录每只动物死亡的时间，特别是最早出现 死亡的时间以及各个剂量组动物的死亡数。分析中 毒死亡时间的规律具有一定意义，可为深入研究化 学物的毒作用机制提供参考。

LD50的计算方法 一、统计学原理 剂量-反应曲线 对称S形曲线 S形曲线 非对称S形曲线 直线 抛物线

1、剂量-死亡率呈偏态分布曲线 实验动物对药物毒性作用的敏感性存在着个体差 异，即每个动物致死所需的剂量与动物的个体差 异有关。多数动物处于中等敏感状态，即符合“ 两头少，中间多”的规律。 如以剂量为横坐标，死亡率为纵坐标，则可绘出 一个偏态曲线，小剂量下毒效应差别较明显，在 大剂量一端，毒效应差别随剂量的增加而减小， 形成拖尾现象。

低敏区域 剂量-死亡率的偏态分布曲线

2. 对数剂量-死亡率呈常态分布曲线 如将横坐标改为对数剂量（等比数列），则就 由偏态曲线转化为对称的常态曲线。 μ为反应中值，б为标准差。曲线下包含的总面 积等于1，在μ±1б的范围内，曲线下所包含的 面积为总面积的68.07％,也即动物死亡率占总死 亡率的68.07%, μ±2б范围内所包含的面积为 95.45%, μ±3б为99.73%。

对数剂量 对数剂量-死亡率的常态分布曲线

3. 剂量对数值与累积死亡率之间呈S形曲线关系 ① 该S形曲线由常态分布曲线累积而来，当剂 量被转换为对数值(X)后，反应机率( P)与X遵循 常态分布。 ② 该S形曲线是向心对称的，对称中心的纵座 标为50％死亡率，横坐标为1ogLD50。

对数剂量—累积死亡率的S型曲线

③该S形曲线的两端平坦，中间较斜。当剂量略有变化时，LD50附近的死亡率变化很大，两端(LD5或 LD95附近)则变化很小，这说明了： A.以LD50来表示致死性毒效应比LD5、LD95更为灵敏精确； B. LD50的误差远小于LD5或 LD95； C.曲线中段死亡率在50％附近的点比5％或95％附近的点更为重要，更能代表大多数动物的反应水平, 这提示我们在设计剂量分组时必须格外重视引起50％死亡效应的剂量组及其邻近的剂量组。

④ Bliss根据常态累积曲线的特点列出了死亡 率各点的“权重系数”作为权衡各点重要性的 定量数值。

Bliss根据常态曲线中的均数、标准差与曲线下面积的关系，设计了由死亡率检索“机率单位”的表格。 4. 剂量对数值与机率单位之间呈直线关系 Bliss根据常态曲线中的均数、标准差与曲线下面积的关系，设计了由死亡率检索“机率单位”的表格。 对数剂量

二、计算方法 大体分为三类： 插入法 (如Horn法) 面积法 (如Karber法) 几率法 (如Bliss几率单位法) 这些方法各有其优缺点，如计算简便但结果粗 略；结果较精确但计算过程繁琐等问题。

1. 孙氏改进寇氏法(点斜法) 孙瑞元于1963年根据点斜式直线方程改进 的Karber法。 基本要求： 各组动物数相等或相近 各组剂量呈等比数列 各组动物的死亡率大致符合常态分布 不要求死亡率一定包括0%与100%

2. Bliss法 利用对数剂量与反应百分率的转换数呈直线 关系而设计的方法。 该法被认为是目前最精确的方法，受到我国 《新药临床前毒理学研究指导原则》的推荐， 计算相当复杂，应用计算机软件计算则简单易 行。

经典急性毒性试验的局限性 1.消耗的动物量大 2.获得的信息有限 3.测得的LD50仅仅是一个近似值 4.在安全性评价中仅评价动物死亡和简单的症 状观察是不够的，更需要的是生理学、血液学 及其它化验检查所提供的深入细致的毒性信息 。

其他急性毒性测定方法 3R原则： 替代（replace） 减少（reduce） 优化（refine）

1. 替代： ①低级动物代替高级动物、小动物代替大动 物。 ②用组织学实验代替整体动物实验。 ③用分子生物学方法替代动物实验。 ④人工合成材料替代动物实验。 ⑤计算机模拟替代动物实验。利用数学及电 脑模式来模拟动物各种生理反应。

2. 减少（reduce）： 减少是指在保证获取一定数量与精确度 的数据信息的前提下，减少动物的使用量 。 通过使用适合的动物品种、品系和高质 量的实验动物，改进实验设计、规范实验 动物操作程序等，达到动物使用数量的减 少。

3.优化（refine）： 优化是指在必须使用动物时，要尽量减少非 人道程序的影响范围和程度。从动物人道主义 去理解，饲养方式、方法符合动物习性，使用 动物做实验时，尽量减少动物痛苦，在处死时 采用安乐死等。

其他急性毒性测定方法 1. 最大给药量法 对于毒性低的化合物可使用最大给药浓度和最大给药容量单次或24h内多次给药，观察反应。 2. 固定剂量法 首先采用1只动物，多为雌性，进行5、50、500、 2000mg/kg 4个固定剂量的毒性测试。将直至确认出现 毒性又无死亡时的剂量作为可行的正式试验剂量。然后 以此剂量对雄雌动物分别进行观察。 其评价标准为高毒、有毒、有害、不分级 4 类

3. 上下法(阶梯法) 该法以死亡为终点但也可用于观察不同的终点。 根据初步的资料确定第一个动物接受化学物的剂量 ，由第1只动物染毒后的反应决定第2只动物接受化 学物的剂量，如果动物死亡，则下一个剂量降低； 如果动物存活则下一个剂量增高，该方法需要选择 一个比较合适的剂量范围，使得大部分的动物所接 受的化学物剂量都在真正的平均致死剂量左右。

4. 近似致死剂量法 介于最小致死量与最大非致死量之间的剂量. 一般选用6只健康的Beagle犬或猴来做试验： A 4. 近似致死剂量法 介于最小致死量与最大非致死量之间的剂量. 一般选用6只健康的Beagle犬或猴来做试验： A.根据动物的体表面积法折算估计可能的剂量 范围。 B. 按50%递增法设计出含10-20个剂量的序列表。 C. 估计可能的致死剂量范围，每间隔一个剂量给一只动物。 D. 给药后连续观察14天。

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