一、概述 二、多糖的纯度测定 三、多糖分子量测定 四、多糖的含量测定 五、多糖类药物的结构分析 多糖类药物的分析 一、概述 二、多糖的纯度测定 三、多糖分子量测定 四、多糖的含量测定 五、多糖类药物的结构分析

第一节 概述: 多糖的分类----来源 动物 植物 微生物 海洋生物 肝素 黄芪多糖 硫酸软骨素 枸杞多糖 香菇多糖 海洋真菌多糖 灵芝多糖 第一节 概述: 多糖的分类----来源 肝素 硫酸软骨素 黄芪多糖 枸杞多糖 动物 植物 活性多糖 微生物 海洋生物 香菇多糖 灵芝多糖 海洋真菌多糖 螺旋藻多糖

组成分类： 均一多糖 不均一多糖 粘多糖：含氮的不均一多糖 结合糖：肽聚糖、脂多糖、糖蛋白(glycoproteins)和蛋白聚糖 糖蛋白通过糖肽键(carbohydrate-peptide linkage) 将糖链和肽链两部分连接起来,连接方式主要分为β-构型的N-糖苷键和α-构型的O-糖苷键.

糖蛋白有三种主要类型 糖蛋白分为三种主要类型：O-糖苷键型糖蛋白、N-糖苷键型糖蛋白和连有磷脂酰肌醇-聚糖的糖蛋白。 在大多数的O-糖苷键型糖蛋白中，GalNAc残基通过O-糖苷键与一个丝氨酸或苏氨酸残基连接形成，缩写为GalNAc-Ser/Thr。 在N-糖苷键型糖蛋白中，GlcNAc残基通过N-糖苷键与一个天冬酰胺残基相连，缩写为GlcNAc-Asn。

O- （N-）糖苷键型糖蛋白 N-糖苷键 O-糖苷键

磷酸乙醇胺残基 磷脂酰肌醇-聚糖的糖蛋白

蛋白聚糖 软骨蛋白聚糖:聚集体的分子量非常大（大约为2×108），其中含有透明质酸、硫酸角质素、硫酸软骨素、连接蛋白、核心蛋白和大量的寡糖链。

多糖组成-单糖 吡喃 六员环糖类似于吡喃，所以又称之为吡喃糖，而五员环糖类似于呋喃，称之为呋喃糖。 环化单糖中氧化数最高的碳称为异头碳。在环式结构中，异头碳是手性碳，所以环化的醛糖或酮糖可以呈现两种异头构型中的一种，即-或-构型。

葡萄糖环状结构

椅式构象 β-D-葡萄糖 α-D-葡萄糖

直链淀粉是葡萄糖以α-1，4糖苷键结合成的链状化合物

纤维素

多糖的理化性质 旋光性 硫酸蒽酮反应（620nm） 硫酸苯酚反应(490nm) 氨基己糖——乙酰丙酮(525nm)

第二节 多糖的纯度测定 （一）超离心法: 单一区带 （二）电泳法： 单一色带 （三）凝胶色谱法： 单一洗脱峰 （四）旋光法： 均一组分

第三节 多糖的分子量测定 凝胶色谱法 粘度法 超离心法 高效液相色谱

凝胶层析法 凝胶层析法：将分子量不同的蛋白质通过一定孔径的凝胶固定相，由于各组分流经体积的差异，使不同分子量的组分得以分离。 最先淋出的是最大的分子。 Kd = 0， Ve= V0 ； Kd = 1 ， Ve= V0+Vi ； 0＜Kd＜1，Ve=V0+KdVi 。

凝胶色谱法 方法： Sephadex G-200，多糖标准品 分部收集，硫酸-苯酚检测，分别求得洗脱体积Ve， Ve与 1gM之间存在着线性关系，绘制标准曲线。 Ve=-KlogM+C 将待测样品上柱，待测多糖Ve。 通过标准曲线求出待测多糖分子量。

粘度法、超离心法 粘度法：用已知结构相似的多糖决定K值（ η ＝ K M2），然后测出待测多糖的特性粘数η ，计算待测多糖的分子量。 超离心法：根据测得的沉降系数计算多糖的平均分子量。

高效液相色谱法测定分子量及分布 色谱条件： 凝胶柱（分子量大小），示差折光检测器。 标准曲线： 标准曲线：LogMW = a+b tR 色谱条件： 凝胶柱（分子量大小），示差折光检测器。　　　　 标准曲线： 标准曲线：LogMW = a+b tR MW为重均分子量，tR为保留时间 待测多糖分子量（GPC专用软件）： 　 重均分子量 Mw=∑(RIiMi)/∑ RIi Mi为供试品在保留时间ti 时的分子量，RIi在第i部分中被洗脱物质的量（重量）。

第四节、多糖的含量测定 比色法（硫酸咔唑法、乙酰丙酮法、硫酸苯酚法、蒽酮法） 生物测定法（肝素钠） 生色底物法（低分子量肝素钠）

乙酰丙酮法（elson-morgan） ——氨基己糖 原理： 氨基己糖在碱性条件下加热，可与乙酰丙酮缩合成吡咯衍生物，该衍生物与对－二甲氨基苯甲醛反应，反应物呈红色，于525nm测定吸收度。

硫酸咔唑法测糖含量 硫酸咔唑法—己糖醛酸测定 在浓硫酸中，己糖醛酸与咔唑溶液反应生成的反应物呈红色。 520nm比色

硫酸苯酚法测定糖含量（总糖） 原理：多糖在浓硫酸作用下水解成单糖，该单糖在强酸性条件下，与苯酚反应生成橙色衍生物。 它在490nm处有最大吸收，其吸光度与浓度呈线性关系。

蒽酮法测定糖含量（总糖） 原理：多糖在浓硫酸中水解后，进一步脱水生产糠醛类衍生物，与蒽酮作用形成蓝色化合物，620nm进行比色测定。 特点：10-100μg范围内其颜色的深浅与糖含量成正比。 灵敏度高。

生物测定法－肝素测定 美国药典采用羊血浆法。 即比较肝素标准品和供试品延长血浆凝结时间的作用来测定肝素的效价。

生物测定法——肝素测定方法 标准品稀释液的配制:精密量取标准品溶液，按高、中、低剂量组（ ds1 、ds2、 ds3 ）用0.9%氯化钠溶液配成三种浓度的稀释液，相邻两浓度的比值为1:0.7。 供试品稀释液的配制：按供试品的标示量或估计效价（AT），照标准品溶液与稀释液的配制法配成高、中、低（ dT1 、dT2、 dT3 ）三种浓度的稀释液。 各管凝结时间换算成对数，照生物检定统计法中的量反应平行线测定法计算效价及实验误差。 可信限率（FL%）不得大于5%。

生色底物法原理－肝素、低分子肝素 当蛋白酶（FⅩa）从生色底物分裂出pNA时，发色物的产生量与剩余的酶量成正比，与肝素效价成反比。 405 nm测定。

生色底物 Bz：苯甲酰，Pip：哌啶酰， Tos：甲苯磺酰；对-硝基苯胺（pNA）。 酰胺分解法（amidolytic method）。 405 nm测定。

生色底物法 以溶液吸收度和浓度的对数，照生物检定统计法中量反应平行线测定法计算出供试品的抗Xa因子活性 可信限率(FL%)不得大于10%。     抗Xa因子活性测定 以溶液吸收度和浓度的对数，照生物检定统计法中量反应平行线测定法计算出供试品的抗Xa因子活性 可信限率(FL%)不得大于10%。      

第五节、多糖类药物的结构分析 单糖组成 糖苷键连接方式 糖苷键连接位置 DNA 蛋白质 多糖 基本单元 4种核苷酸 天然20种氨基酸 200多种单糖，常见20余种 每种单糖存在异构体 连接键 3’-5’磷酸二酯键 N-C肽键 1-1, 1-2, 1-3, 1-4, 1-6糖苷键 连接键构型 一种 存在α、β两种构型

二肽与双糖 2个相同氨基酸连接形成的二肽仅1种 2个相同单糖连接形成的双糖有11种 Ala Glc-Glc 1-1连接 1-2连接 1-3连接 1-4连接 1-6连接 α型 三种海藻糖 （α-α，α-β，β-β） 曲二糖 黑曲二糖 麦芽糖 异麦芽糖 β型 槐糖 昆布二糖 纤维二糖 龙胆二糖

（一）多糖组成单糖的分析 1、水解方法 （1）、完全酸水解法 （2）、部分酸水解、碱水解 （3）、乙酰解 （4）、甲醇解 （5）、酶降解 2、鉴定

（1）、完全酸水解法 水解难易取决单糖性质及构型。 呋喃型戊聚糖较吡喃型己聚糖易水解，α型较β型易水解。 已聚糖一般用1 mol/L硫酸，70℃，8小时。 氨基葡聚糖为4 mol/L盐酸，100℃ 9小时。

（2）、部分酸水解、碱水解 选择温和的条件水解多糖，使糖链中某种类型的键特异性地打断。 （3）、乙酰解 多糖经过乙酰解反应（醋酐、冰醋酸）可生成乙酰化单糖和寡糖

（4）、甲醇解 多糖链在80－100℃条件下与无水甲醇反应能将糖链变成组成单糖的甲基糖苷。 甲基糖苷能转化为三甲基硅醚衍生物或乙酰基衍生物，进行气相色谱分析。

（5）、酶降解 分为外切糖苷酶和内切糖苷酶。 外切糖苷酶：切下多糖非还原末端的一个单糖，并对单糖组成和糖苷键有专一性要求。 内切糖苷酶可水解糖链内部的糖苷键，释放多糖链片断以利于结构分析。

2、单糖的分离鉴定 气相色谱法 高效液相色谱法 气相色谱法与质谱分析连用

气相色谱法 常用的衍生物有： 三甲硅烷（TMS）衍生物 三氟乙酰（TEA）衍生物 乙酰（AC）衍生物 甲基（Me）衍生物

二、糖苷键连接方式的测定 红外光谱——糖苷键类型 核磁共振谱——糖苷键（α型或β型）。 确定吡喃糖糖苷键时，用红外光谱，在890cm-1处有特征吸收者，示有β-型糖苷键，在840cm-1处有特征吸收者，示有α-型糖苷键。 核磁共振谱——糖苷键（α型或β型）。 H-NMR谱中的化学位移δ5.4 和δ 5.1 ，有两个信号说明分子结构中的糖苷键为α型，如有δ 4.53说明有β型。

三、糖苷键连接位置的测定 （一）、高碘酸氧化、Smith降解 （二）、甲基化反应产物分析 （三）、乙酰解后质谱分析

（一）高碘酸氧化、Smith降解 原理： 选择性的氧化降解反应，能够作用于多糖分子中1，2—二羟基和1，2，3—三羟基，生成过碘酸氧化产物；此产物用硼氢化钠还原后，再用酸水解，生成相应的醛、甲酸。 室温下用稀无机酸水解还原产物。

1，2连接的糖苷键 1，2连接的糖苷键经高碘酸氧化后的产物用硼氢化钠还原得到稳定的多羟基化合物，再用稀盐酸水解，得到甘油及甘油醛。 方程式：

1，3连接的糖苷键 1，3连接的糖苷键与高碘酸不起反应，经还原与水解后得到原来的单糖。 方程式：

1，4连接的糖苷键 1，4连接的糖苷键经高碘酸氧化后的产物用硼氢化钠还原，用稀盐酸水解得到最终产物为赤藓醇和乙醇醛。

1，6连接的糖苷键 1，6连接的糖苷键经高碘酸氧化后的产物用硼氢化钠还原得到稳定的多羟基化合物，再用稀盐酸水解，得到甘油及乙醇醛。

（二）甲基化反应产物分析 原理：多糖经甲基化试剂作用使分子中的羟基甲基化，然后用甲酸和三氟醋酸水解，以气相色谱鉴定甲基化水解产物。 如多糖分子中带有支链，甲基化水解后可生成二甲基单糖。

（三）乙酰化后质谱分析 原理：多糖经过乙酰化反应（醋酐、冰醋酸）生成乙酰化单糖和寡糖。 用氯仿抽提，蒸去氯仿，进行质谱分析。 分子离子峰如有二乙酰葡萄糖或二乙酰单糖碎片峰，表明有支链结构。

2015年版《中国药典》收载的多糖类药品 品种 来源 类别 剂型 右旋糖酐 20 发酵 血浆代用品 粉剂 右旋糖酐 20葡萄糖注射液 右酐20、葡萄糖 注射剂 右旋糖酐 20氯化钠注射液 右酐20、氯化钠 右旋糖酐 40 右旋糖酐 40葡萄糖注射液 右酐40、葡萄糖 右旋糖酐 40氯化钠注射液 右酐40、氯化钠 右旋糖酐 70 右旋糖酐 70葡萄糖注射液 右酐70、葡萄糖 右旋糖酐 70氯化钠注射液 右酐70、氯化钠 右旋糖酐铁 络合物 抗贫血药 右旋糖酐铁片 右酐铁 片剂 右旋糖酐铁注射液 肝素钠 猪、牛肠粘膜 抗凝血药 肝素钠注射液 肝素钠乳膏 软膏 硫酸软骨素钠 猪喉骨、鼻中骨、气管 酸性粘多糖类 硫酸软骨素钠片 硫酸软骨素钠胶囊 胶囊剂

实例：右旋糖酐（dextran） 右旋糖酐，又称葡聚糖，是若干个葡萄糖脱水形成的聚合物。 微生物多糖，也是第一个工业化的微生物多糖，是由肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）发酵产生的。 产物的分子量很大，经水解后，用不同浓度乙醇多定分级沉淀，得到中、低、小分子量的右旋糖酐成品。 临床上使用的是平均分子量为16000~24000，32000~42000和64000~76000的右旋糖酐20、右旋糖酐40和右旋糖酐70，它们均是用做代血浆。

一、结构与理化性质 右旋糖酐的结构：它主要由葡萄糖（1→6）α-糖苷键连接而成，同时含有(1→3)α-和(1→4)α-糖苷键连接形成的分支结构。 右旋糖酐为白色无定形粉末，无臭、无味，易溶于热水。 右旋糖酐溶于水后形成有一定粘度的胶体溶液，在乙醇等有机溶剂中不溶。

二、鉴别 右旋糖酐经碱性水解后产生葡萄糖，葡萄糖可使Cu2+还原为红色氧化亚铜沉淀。 操作方法：取本品0.2 g，加水5 ml溶解后，加氢氧化钠试液2 ml与硫酸铜试液数滴，加热后变成红棕色沉淀 。

三、检查 右旋糖酐的检查项目较多，其中氯化物、重金属、干燥失重、炽灼残渣的检查参见中国药典2015年版二部附录，此外还有氮、分子量与分子量分布的检查。 氮:用发酵法制备右旋糖酐时，发酵滤液中存在着微量蛋白质。

氮 取本品0.2 g，置50 ml凯氏烧瓶中，加硫酸1 ml，加热消化至供试品成黑色油状物，放冷，加30%过氧化氢溶液2 ml，加热消化至溶液澄清，冷却至20℃以下，加水10 ml，滴加管中，再用水稀释至刻度，缓缓加碱性碘化汞钾试液2 ml，随加随摇匀；如显色，与标准硫酸铵溶液(每1 ml相当于10 μg的N)1.4 ml加硫酸0.5 ml用同一方法处理后颜色比较，不得更深(0.007%)。

分子量与分子量分布 右旋糖酐20： 3500 —— 7万 右旋糖酐40： 5000 ——12万 右旋糖酐70： 15000 ——18.5万

四、含量测定 旋光光度法，根据右旋糖酐水溶液的旋光度在一定范围内与浓度成正比来测定含量。 以右旋糖酐40氯化钠注射液的含量测定为例。 取本品10 ml，置50 ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，照旋光度测定法测定，按下式计算右旋糖酐的含量C=0.5128α C为每100 ml注射液中含有右旋糖酐的重量； α为测得的旋光度×稀释倍数。

第三节 多糖的分子量测定 凝胶色谱法 粘度法 超离心法 高效液相色谱——重均分子量

四、多糖的含量测定 比色法（硫酸咔唑法、乙酰丙酮法、硫酸苯酚法、蒽酮法） 生物测定法（肝素钠） 生色底物法（抗FⅩa 活性）

第五节、多糖类药物的结构分析 单糖组成 糖苷键连接方式 糖苷键连接位置——高碘酸氧化、Smith降解