PI3K/AKT信号传导通路对鼻咽癌转移的影响 广东医学院病理教研室 导师： 姜汉国 副教授 研究生: 胡蕾

一、 研究意义及国内外研究现状 多发生于广东珠江三角洲地区及广西等地。 患者常在颈部淋巴结发生转移后，因颈部肿物才来就诊，已属晚期。 约有40％－60％的鼻咽癌患者死于鼻咽癌复发或远处转移，研究其转移的机制成为治疗鼻咽癌防止其恶性进展的一个重要方面。

恶性肿瘤的转移机理研究 早期即有“种子土壤学说” 后来人们又发现肿瘤的转移与血管有关，血管生成的增强和肿瘤转移能力成正相关 现今细胞信号传导通路对转移的影响也成为近几年一大研究热点

PI3K/AKT（磷脂酰肌醇3激酶/丝氨酸苏氨酸激酶）信号传导通路的异常改变常出现于人类一些恶性肿瘤组织中，与肿瘤的进展密切相关，以往多有报道PI3K/AKT过度表达常发生于卵巢癌，宫颈癌，乳腺癌，等中。而鼻咽癌及高转移鼻咽癌中通路的异常表达未见报道

PI3K的结构简介 PI3K主要由一个催化亚基P110和一个调节亚基P85组成。P85的N端含有一个SH3区和一个能与其他蛋白质的SH3区结合的富含脯氨酸序列，其C端含有两个SH2区和一个位于两个SH2区之间可结合P110的结构区。P110可催化自身和其他蛋白磷酸化。

为癌基因akt的产物。其有三种亚型AKT1.AKT2.AKT3。三者都含有一个N端PH域，一个激酶催化域和一个C端调节域。

PI3K/AKT通路的激活 首先 生长因子 癌基因 －PI3K活化－磷酸 化PIP2－生成PIP3 其次 PIP3与AKT结合－AKT构相改变 同时 PIP3与PDK结合 AKT与PDK靠近

最后 在PDK1的直接或间接催化下 催化AKT结构域的THR308位点 再在LK即整合素连接激酶的 作用 下催化羧基端尾区的SER473位点 也发生磷酸化 最终 AKT充分活化

PIP2磷酸化生成PIP3 生长因子，癌基因 PI3K激活 PIP3与PDK结合 AKT与PDK靠近PDK磷酸化AKT PIP3与AKT结合 LK磷酸化AKT AKT THR308位点磷酸化 AKT活化 AKT SER473位点磷酸化

活化的AKT BAD磷酸化 凋亡受抑 活化核转录因子 c－myc表达 Bcl-2表达 细胞存活生长

高崇峰，吕有勇发现，根据临床病理材料的分析表明，在低分化，有淋巴结转移，临床分期3期的胃癌组织中AKT2表达增强。 该通路的过度表达出现于胃癌，乳腺癌，胰腺癌，卵巢癌，等。 高崇峰，吕有勇发现，根据临床病理材料的分析表明，在低分化，有淋巴结转移，临床分期3期的胃癌组织中AKT2表达增强。

康春生等人研究发现人脑胶质瘤按恶性程度分为1，2，3，4期，恶性程度越高则AKT2表达水平越高，提示AKT2与侵袭性和转移有关。

Arboleda发现同样的事件于卵巢癌，乳腺癌中。 另有蒋虹等人研究结果显示AKT蛋白表达与食管癌的临床病理分期，淋巴结转移，分化程度相关，2－3期无淋巴结转移，高分化食管癌组织AKT蛋白表达低于3－4期，有淋巴结转移，低分化食管癌，证实AKT有促进食管癌细胞黏附，侵袭，转移的作用。 Arboleda发现同样的事件于卵巢癌，乳腺癌中。

由此假设PI3K/AKT在鼻咽癌中存在并过表达于发生淋巴结转移鼻咽癌组织中 ，其与转移相关。

AKT促进细胞侵袭和转移的机制 1 、AKT磷酸化eNOS的Ser1177、1179（牛，人），使之活化,eNOS活化导致NO产生，NO直接的上调ICAM的表达有关。 2、 经过AKT/mTOR/P70S6K途径,P70s6k的活化促进肌动蛋白的细丝重构，促进细胞的运动。

3、经PI3K/AKT/mTOR途径，上调MMP－2mRNA和蛋白质表达。 4、活化的AKT能够增加NF－kB的转录活性，使MMP－9产量增加且细胞运动增强，有助于癌细胞转移；NF－kB还能上调COX－2的表达，有助于细胞侵袭的发生。

5、用表达构建的活性AKT转染的鳞状上皮细胞癌细胞株中，E－钙粘素表达下调，增加了细胞的运动性.

6、 JIANG对该通路的研究发现，正常血管生成需要PI3K/AKT途径。VEGF的mRNA水平在有活性的PI3K或AKT表达的细胞明显升高，这种升高的水平能被PI3K抑制剂LY294002所降低，提示PI3K在血管生成及调节VEGF表达方面起重要作用。

1，AKT磷酸化eNOS，使之活化，而eNOS与肿瘤生成有密切关系。 2，AKT通过多种途径上调HIF－1α ，HIF－1 α促进VEGF的表达。

3，活化的AKT引起IkB磷酸化， NF-kB水平上调COX－2的表达。 以上参考文献略，详见打印本。

二、创新之处 以往大量报道PI3K/AKT在乳腺癌，肺癌，大肠癌，等癌中的异常表达且在食管癌转移中的表达明显高于非转移食管癌，但鼻咽癌中该通路的研究尚未见报道。

四、研究目标 研究内容 拟解决关键问题 研究目标：文献报道许多癌组织中过表达PI3K/AKT,本实验试图证实已发生转移鼻咽癌中该通路表达增加，阻断该通路后与转移有关的各蛋白因子水平下调，从而证实该通路激活过表达促进癌细胞转移。

研究内容： 1、 研究临床标本，鼻咽癌及有淋巴结转移鼻咽癌中p-AKT,PI3K的表达情况，从该通路的关键激酶,及下游P70S6K，蛋白表达，分析该通路是否在转移癌中过表达。

2、 复苏和培养的低转移鼻咽癌细胞株CNE－2Z及高转移CNE－2Z－H5－9鼻咽癌细胞株，同时给予另一组高转移CNE－2Z－H5－9鼻咽癌细胞株PI3K/AKT通路的阻滞剂。分别检测三组肿瘤细胞黏附能力和侵袭能力。

3、 用阻滞剂阻滞CNE－2Z－H5－9中该通路及观察细胞运动能力的变化以便探讨该通路对促癌转移作用。

拟解决的关键问题：      1  鼻咽癌转移是否同PI3K/AKT通路有关。   2 PI3K/AKT通路拮抗剂对鼻咽癌转移的影响。

五．拟采取研究方法 1 鼻咽癌细胞CNE－2Z及CNE－2Z－H5－9的复苏培养。 2 免疫组化检测鼻咽癌与有淋巴结转移鼻咽癌组织p－AKT，PI3K，P70S6K的表达情况。    

3 Western－blot检测CNE－2Z及CNE－2Z－H5－9中PI3K，P70S6K，pAKT，的表达。 RT－PCR检测P－AKT PI3K VEGF的mRNA的水平。 ELISA检测P－AKT，PI3K ，MMP－2 的表达

4 Transwell检测通路阻滞后细胞运动能力。

六: 技术路线图－临床病理部分 鼻咽癌 已发生淋巴结转移的鼻咽癌 免疫组化 pAKT PI3K P70s6k

Western－Blot ELISA RT－PCR Transwell 实验病理部分 CNE－2Z CNE－2Z－H5－9 CNE－2Z－H5-9 加抑制剂 Western－Blot ELISA RT－PCR Transwell PI3K pAKT P70s6k MMP－2 VEGF 细胞运动能力

七、可行性分析 鼻咽癌标本和发生淋巴结转移的鼻咽癌标本可从附院获取。 CNE－2Z和CNE－2Z－H5－9细胞本实验室有冻存。   CNE－2Z和CNE－2Z－H5－9细胞本实验室有冻存。 所需各种试剂均有出售

八．预期结果 金费预算 和进度安排 1． 有淋巴结转移的鼻咽癌组织中PI3K，P70S6K，pAKT各项指标表达均高于无淋巴结转移的鼻咽癌。 八．预期结果 金费预算 和进度安排 1． 有淋巴结转移的鼻咽癌组织中PI3K，P70S6K，pAKT各项指标表达均高于无淋巴结转移的鼻咽癌。 2 通路阻滞剂的加入后CNE－2Z－H5-9的细胞运动能力下降。

3 CNE－2Z－H5-9鼻咽癌细胞中，PI3K，pAKT，P70s6K， MMp－2 VEGF的表达高于CNE－2Z鼻咽癌细胞中    3 CNE－2Z－H5-9鼻咽癌细胞中，PI3K，pAKT，P70s6K， MMp－2 VEGF的表达高于CNE－2Z鼻咽癌细胞中

金费预算 1、 免疫组化：2000元 2、 RT－PCR：2000元 3、 Western－Blot:1400元 4、 ELISA： 4000元 5、 Transwell：2000元 总计：11400元

进度安排： 2005．11. 1－2006. 1. 1 细胞培养 2006. 1. 1－2006. 12. 1 细胞实验部分 2006. 12. 1－2007. 2. 1 免疫组化部分 2007. 2. 1－2007. 4. 1 数据整理分析，论文撰写，申报成果。

请各位老师批评指正 谢谢大家！