白血病突变组分析（mutaome）暨基因突变筛查项目介绍 陆道培血液•肿瘤中心 分子诊断室 刘红星 lhongxing@gmail.com 18600381635 2012-9-28 陆道培血液•肿瘤中心 院内报告

肿瘤突变组（mutaome） 于2012年8月陆道培血液•肿瘤中心主办的血液病诊断和治疗研讨会上首次提出“突变组”的概念 每一个肿瘤细胞都是多种基因突变积累的结果 在特定的患者、特定时间，其肿瘤细胞携带的突变组合不同 不同的突变组合决定了每个患者独特的发病过程、病理生理学表现、治疗反应和病情发展 有明确意义的基因突变越来越多被鉴定 全面了解肿瘤基因突变情况 更精细地诊断分型、评估预后、制定个体化治疗方案 基因突变筛查是经济有效的方法

常见的肿瘤基因异常类型 基因突变： 单个或多个碱基异常 融合基因： 染色体宏观结构异常 基因表达异常： 原癌基因活化或抑癌基因失活，WT1等 G>T JAK2 V617F 基因表达异常： 原癌基因活化或抑癌基因失活，WT1等

白血病分子诊断应用现状和展望 融合基因 基因突变 原癌基因 历史：发现染色体易位 — 鉴定融合基因 历史：发现染色体易位 — 鉴定融合基因 转录组测序 — 将发现更多隐匿性易位或微缺失形成的融合基因 基因突变 传统方法不易发现，目前鉴定较少 肿瘤外显子组测序大大促进了肿瘤基因突变的鉴定 原癌基因 正常组织器官也可能表达，特异性和灵敏性的问题 Translocation

Michael R. Stratton et. al, NATURE, Vol 458, 9 April 2009

每个肿瘤都是基因变异的团伙在犯罪 主犯 帮凶 从犯 不明真相的参与者 过客突变 JAK2、MPL、CEBPA、NPM1等突变 KIT、FLT3、DNMT3A、TET2、P53等突变 从犯 原癌基因活化：WT1、HOX11 不明真相的参与者 PIGA等突变 过客突变 无功能的突变。我只是来打酱油的。。。

不同突变在肿瘤发生中的作用不同 信号传导 转录因子 表观遗传学 转录剪接 抑癌基因失活、基因修复缺陷 免疫监视缺陷 NRAS、KRAS、PTPN11、CBL、JAK2、MPL。。。 转录因子 RUNX1、ETV6。。。 表观遗传学 TET2、DNMT3A、IDH1、IDH2、ASXL、EZH2。。。 转录剪接 SF3B1、SRSF2、U2AF1。。。 抑癌基因失活、基因修复缺陷 TP53、FA相关基因突变。。。 免疫监视缺陷 HLA缺失、PRF1突变。。。

Jay P. Patel, et al., N Engl J Med 2012;366:1079-89 肿瘤突变组分析临床应用的范例 97.3%的AML患者携带其中一种或以上的基因突变 预后差：FLT3-ITD、MLL-PTD、ASXL1、PHF6 预后好：CEBPA、IDH2、NPM1伴IDH1/IDH2突变 伴DNMT3A、NPM1突变、MLL易位患者，采用大剂量的柔红霉素治疗可提高生存率 Prognostic Relevance of Integrated Genetic Profiling in Acute Myeloid Leukemia Jay P. Patel, et al., N Engl J Med 2012;366:1079-89

MPN中常见的基因突变

MDS中常见的基因突变

不同类型白血病间的分子克隆演变

肿瘤突变组分析临床应用的意义 只根据一种融合基因分类的患者仍有异质性 只检测一种突变也是不够的 新的突变出现可预示临床进展 AML1-ETO VS. AML1-ETO+KIT突变 只检测一种突变也是不够的 NPM1 VS. FLT3 VS. NPM1+FLT3 新的突变出现可预示临床进展 急变、耐药等 对肿瘤突变组的全面了解有助于指导个体化治疗

分子诊断的发展趋势及挑战 Lucy A. Godley, DOI:0.1056/NEJMe1200409

分子诊断临床应用遇到的问题 临床医师如何认识新发现的基因突变的意义？ 实验室如果向临床医师推荐新的项目？ 如何提高突变的检测灵敏度？ 如何降低检测费用？提高发现分子标记的速度？

我们的解决方案 -- 基因突变筛查 AML基因突变筛查（11种） ALL基因突变筛查（11种） MPN基因突变筛查（7种） CEBPA；DNMT3A；FLT3-ITD/TKD；IDH1；IDH2；KIT；KRAS；NPM1；NRAS；TET2；WT1 ALL基因突变筛查（11种） FBXW7；FLT3；KRAS；IKZF1；JAK1；JAK2；NOTCH1；NRAS；PAX5；PHF6；MLL-PTD MPN基因突变筛查（7种） IDH1；IDH2；JAK2；KIT；MPL；SH2B3(LNK)；TET2 MDS基因突变筛查（8种） DNMT3A；IDH1；IDH2；JAK2；MPL；SF3B1；SRSF2；TET2

不远的将来：高通量基因测序的应用 降低单位检测成本 深度测序 – 突变MRD监测 IG、TCR免疫组库分析 加入更多的检测内容 外显子组突变分析，真正的肿瘤“全突变组”分析成为可能 深度测序 – 突变MRD监测 IG、TCR免疫组库分析

基因突变筛查的特点和意义 同一患者可能同时存在多种基因突变 基因突变在疾病发展过程中可能会变化 目前大多数基因突变作为MRD监测指标有困难 可与融合基因或其它基因突变同时存在 同一患者的同一基因可能存在不同的突变 克隆性判断；诊断分型；预后判断；个体化用药 基因突变在疾病发展过程中可能会变化 FLT3、IKZF1等，与疾病进展有关 目前大多数基因突变作为MRD监测指标有困难 用高通量测序进行深度测序分析可帮助实现 可以用初诊时的石蜡、涂片标本回顾性分析 帮助选择合适的治疗方案、评估预后等

病例 男，30岁，形态学为M1型，柔红霉素+阿糖胞苷化疗一疗程后 NPM1突变阳性 定量42.15% FLT3突变阳性 31种融合基因阴性，HOX11表达阳性 形态学证明未缓解，从当地医院转某大医院治疗

白血病分子诊断的建议 初诊患者 外地治疗后来诊患者 出现全面复发或疾病类型转化时 骨髓或外周血标本，融合基因筛查、基因突变筛查 后续根据融合基因、基因突变结果定点监测 外地治疗后来诊患者 肿瘤细胞>30%： 肿瘤细胞<30%： 骨髓或外周血标本，融合基因筛查； 初诊时骨髓片、病理组织、DNA标本，基因突变筛查 出现全面复发或疾病类型转化时 基因突变筛查，需要时做融合基因筛查

基因突变筛查方案的关键技术 操作便利性、效率、成本控制 高性能的基因工程改造的聚合酶 同一的反应条件、多重PCR、巢式PCR 提高效率、防污染控制、节省标本、保证成功率 通用测序引物的使用 减少测序的工作量、简化操作 片段长度控制 兼容二代测序，特别设计的测序引物 测序结果分析

致谢 分子诊断室： 检验科其它实验室和临床协作 其它协作医院 王芳、滕文、王岩、牛倩、王旭、郭磊、王昊、 樊江燕、管少帅、王绵绵、尹青 Email: lhongxing@gmail.com 新浪微博：陆道培血液肿瘤中心刘红星

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