PCR 及分子标记

PCR(Polymerase Chain Reaction) Three steps: denaturation, primer annealing, polymerization. Peoples Choice Reaction 生命经纬 www.biox.cn

The PCR cycle 95℃ step to denature the duplex DNA, An annealing step of around 55℃ to allow the primers to bind, 72℃ polymerization step. Mg2+,dNTPs are required in addition to template,primers,buffer and enzyme 生命经纬 www.biox.cn

Khorana（1971）：美国MIT教授、1968年诺贝 历史 60s-70s：基因的体外分离技术。 Khorana（1971）：美国MIT教授、1968年诺贝 尔医学奖得主 “经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。 核酸体外扩增最早设想遗忘: 当时很难进行测序和合成寡核苷酸引物； 当时(1970)Smith等发现了内切酶，体外克隆基因成为可能 生命经纬 www.biox.cn

Kary Mullis(1985) 发明过程 Mullis 在“偶然想出的聚合酶链反应”一文中写到: “这种简单得令人惊奇，可以无限量地拷贝DNA片段的方法是在不可想象的情况下，即驾车行驶在月色下的加利福尼亚山间公路上时想出来的”。 发展过程： 开始使用大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段，该酶不耐热，每次加热变性DNA后都要重新补加。耗时、费力、易出错。耐热DNA聚合酶的应用使得自动化。 生命经纬 www.biox.cn

美国专利局驳回DuPont异议，地方法院判属Cetus 专利官司 1987年美国专利局专利授权 1989年，DuPont异议，大小公司对簿公堂，将决定谁将获得诺贝尔奖。DuPont理由是，1971年PCR的雏形已由Khorana一系列文章阐明，并公布于众，应当是公共产权。斯坦福大学Kornberg（研究DNA聚合酶获诺贝尔奖）也认为，任何具备生物技术知识的人都可以从Khorana等的文章中推知如何操作PCR。 美国专利局驳回DuPont异议，地方法院判属Cetus Cetus获胜后马上反诉，指出DuPont已侵犯另一项与PCR有关的专利并要求对方赔偿以及不再销售与PCR有关试剂和仪器 生命经纬 www.biox.cn

PCR发展速度 惊人，没有一种技术能与之相比 引用论文最多、应用范围十分广泛 1993年度诺贝尔化学奖：Mullis，与开创了“寡核苷酸基因定点诱变”加拿大籍英国科学家Michael Smith共获 生命经纬 www.biox.cn

原理 类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。 生命经纬 www.biox.cn

procedures template(DNA or RNA), primers, Taq enzyme, 10×PCR buffer, Mg++, 5mmol/L dNTPs pre-denaturation--denature completely Denaturation annealing Elongation cycles:25-30 生命经纬 www.biox.cn

Primer design Most imp. (1)length: 20～30bp (2)G+C contents:ATCG random distributed (3)primers : no complementary sequence (4)3‘end of the primer: no modification (5)5‘end of the primer:product length，can be modified (6) specificity:less than 70% homology with non-specific amplification sequence, or 8bp continuous complementary base 生命经纬 www.biox.cn

Primer designed with the help of computer DNA database conservative region comparision primers or blast 生命经纬 www.biox.cn

PCR reaction components and their functions template：ssDNA, dsDNA mRNA needed to be RT as cDNA samples：from blood,sperm or any other tissue,from older forensic specimens, from ancient biological samples or in the lab. From bacterial colonies or phage plaques. DNA：very stable 生命经纬 www.biox.cn

Store:纯化引物在25％乙腈溶液中4℃；冻干引物于-20℃可保存1-2年，液体状态于-20℃可保存6个月。不用时应-20℃保存。 primes If the PCR product is to be cloned, it is sensible to include the sequence of unique restriction enzyme sites within the 5’-ends of the primers. Can amplify fragments over 10kb in length Store:纯化引物在25％乙腈溶液中4℃；冻干引物于-20℃可保存1-2年，液体状态于-20℃可保存6个月。不用时应-20℃保存。 生命经纬 www.biox.cn

10-50mmol/L Tris-HCl(pH8.3-8.8, 20℃)。 Mg2+：for Taq polymerase activity buffer 10-50mmol/L Tris-HCl(pH8.3-8.8, 20℃)。 Mg2+：for Taq polymerase activity conc.:Low:low activity high: non-specific amplification dNTPs： 贮备dNTP液：1 mol/L NaOH 调pH至中性。 贮备浓度为5-10mmol/L，终浓度为20-200umol/L，分装-20℃保存。 4种dNTP浓度应相同。 生命经纬 www.biox.cn

mineral oil Taq DNA polymerase： from thermophilic bacteria. Taq polymerase from Thermus aquaticus. other thermostable DNA polymerase with greater accuracy used for certain applications. mineral oil 生命经纬 www.biox.cn

Selection for DNA polymerase Klenow酶 早期采用 该酶不耐热，缺点有 ①温度要求低(37℃)，受热即失活； ②产物特异性不高； ③积累大量的失活残酶，使反应产物纯度大大降低； ④扩增的最长序列约400bp（Taq酶则能扩增10kb） 生命经纬 www.biox.cn

thermostable DNA polymerases ①Taq DNA polymerase ②Tth DNA polymerase—from T.thermophilus ③VENT DNA polymerase—from T.litoralis ④Sac polymerase ⑤pfu polymerase 生命经纬 www.biox.cn

Taq DNA聚合酶 分离:1969年，美国黄石国家公园温泉 分子量:94KDa 活性：在几种水生栖热菌中活性最高，200 000U/mg 生命经纬 www.biox.cn

Taq DNA聚合酶 离子需要：对Mg2+、单价离子性质和浓度较 敏感。最适浓度为50mmol/L。 忠实性:没有校正单核苷酸错配功能--致命弱点。一般出错率为2×10-4核苷酸/每轮循环，利用PCR克隆、测序时尤应注意。 生命经纬 www.biox.cn

Taq DNA聚合酶 抑制剂:尿素、乙醇、DMSO、DMF、甲酰胺、SDS及许多其他化学药剂。 内源DNA:不同来源的酶可能由于制备过程中残留的原细菌DNA或PCR产物的污染而含有不明来源的DNA。在使用扩增保守序列的通用引物时，会在无模板对照管出现扩增带。 保存:在-20℃至少6个月。 生命经纬 www.biox.cn

92-95℃，富含G和C的序列，可适当提高，但过高或时间过长都会导致酶活性损失。 退火温度与时间 PCR optimization 变性温度和时间 92-95℃，富含G和C的序列，可适当提高，但过高或时间过长都会导致酶活性损失。 退火温度与时间 引物中G、C含量高、长度长并与模板完全配对时，应提高温度。温度越高，产物特异性越高。通常37-55℃、1-2分钟。 延伸温度和时间 温度：72℃，接近Taq酶的最适75℃ 时间：过长会导致产物非特异性增加。但对低浓度的目的序列，则可适当增加时间。 循环次数 循环过多，非特异性产物大量增加 生命经纬 www.biox.cn

①点样器和加样器;②离心机;③微解剖刀;④浓缩用具、真空瓶;⑤电泳装置;⑥紫外灯箱;⑦乙醇或水浴锅;⑧冰箱门把手、实验台面等 PCR污染及其对策 强大扩增能力+检测的敏感性 极微量的污染便可导致假阳性 污染源的追踪 ①点样器和加样器;②离心机;③微解剖刀;④浓缩用具、真空瓶;⑤电泳装置;⑥紫外灯箱;⑦乙醇或水浴锅;⑧冰箱门把手、实验台面等 生命经纬 www.biox.cn

污染的预防 隔离不同操作区 分装试剂 改进实验操作 专用加样器 (5)结果的重演 生命经纬 www.biox.cn

PCR技术的应用

遗传性疾病 地中海贫血的基因诊断 血友病 苯丙酮尿症 生命经纬 www.biox.cn

传染性疾病 肝炎 性病 肿瘤 生命经纬 www.biox.cn

法医学 个人识别、亲子鉴定 1985年，英国遗传学家Jeffreys采用DNA 指纹图谱进行个人识别和亲子鉴定。 有时犯罪物证量很少，不足以用来进行DNA指纹分析，PCR有效解决这些问题。对于犯罪现场中遗留的少量生物物证，如一根毛发、一滴血等都可用于分析，在法医学上认证罪犯、亲子鉴定以及人的性别鉴定中PCR技术被普遍采用。 生命经纬 www.biox.cn

植物遗传育种 构建遗传图谱、分离目的基因、 基因定位 分子标记辅助育种 了解不同品种间的亲缘关系、系统进化 生命经纬 www.biox.cn

畜 牧 畜禽病诊断:猪伪狂犬病毒、猪口蹄疫病毒、猪瘟病毒、牛白血病毒、牛病毒、性腹泻病毒、免疫缺陷病毒等检测 性别鉴定：牛、绵羊Y染色体上特异 DNA片段 构建基因图谱 检测基因整合与表达：转基因鱼 生命经纬 www.biox.cn

植物保护 杀虫病原微生物的基因型鉴定 植物病原微生物分类 形态学上相似性和潜在的血清学交互反应，用常规方法难以区分，采用反转录PCR（RT-PCR）可准确快速区分 生命经纬 www.biox.cn

其他 ①考古学 ②植物分类学 ③群体生态学 生命经纬 www.biox.cn

Molecular marker

Introduction 形态标记、细胞学标记、生化标记 数十种技术问世。 万变不离其宗：分子杂交、PCR扩增 第一类：电泳、分子杂交为核心 代表：RFLP、DNA指纹 第二类：电泳、PCR为核心 代表：RAPD、SSR、AFLP 第三类：DNA序列为核心 代表：ITS测序分析 生命经纬 www.biox.cn

优点 数量丰富、信息量大； 与生长发育无关，取材不受限制； 较多共显性，信息量完整 在真核生物中，基因组DNA多态性要远远多于各种基因的遗传多态性，因为基因组中存在着大量的不编码的DNA序列，它们的变异不受或较少地受自然选择的制约 生命经纬 www.biox.cn

Applications 种质资源研究 品质纯度鉴定（包括DNA指纹鉴定） 构建遗传连锁图 基因定位（QTL） 标记辅助选择 比较基因组研究 基因克隆（图位克隆） 生物起源、进化、医学及法医学 生命经纬 www.biox.cn

RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism) by Botstein(1980) 基本原理：物种的基因组DNA在限制性内切酶作用下，产生相当多的大小不等的片段，用放射性同位素标记的DNA作探针，把与被标记DNA相关的片段检测出来，从而构建出多态性图谱。 优点:共显性，非常稳定 缺点：检测步骤多，周期长，费时、费钱； 用作探针的DNA克隆制备、保存不方便； 放射性同位素 自从人的RFLP图谱构建后，又分别构建了果蝇、牛、大豆、小麦、水稻等多种生物的RFLP图谱。 生命经纬 www.biox.cn

RAPD(Random Amplified Polymorphism DNA) 1990: Williams(Du Pont)：RAPD; Welsh(Cal.Biology Inst.)：AP-PCR(Arbitrary Primer-PCR) =Random Primer-PCR =Oligo Primer-PCR =SODA(Small Oligo DNA Analysis） Rapid and simple Random primer:9-10bp 生命经纬 www.biox.cn

常规PCR中需要两个引物，长度20-30个核苷酸。RAPD只需一个引物，长度9-10个核苷酸，而且是随机引物。 B.退火温度低 RAPD引物短，因此退火温度要低，一般为35-37℃。 生命经纬 www.biox.cn

通用性 --不需先知道基因组的任何分子信息 --实验步骤少，省工、省力、进度快 --不需先知道基因组的任何分子信息 --所用材料不需有性世代，可用任何单一亲本、任何部位的材料，在没有有性世代的线粒体、叶绿体DNA研究中也可使用； --引物没有严格的种属界限，同一套引物可用于任何一种植物的研究，具有广泛性和通用性。 生命经纬 www.biox.cn

RAPD标记从理论上讲是无限的，而且在端粒及重复顺序上可以找出RAPD标记位点，因此可以做出很密集、很详细的遗传图来。 植物分子生物学中的应用 用于种属特异性鉴定 外源导入基因的追踪 遗传作图 RAPD标记从理论上讲是无限的，而且在端粒及重复顺序上可以找出RAPD标记位点，因此可以做出很密集、很详细的遗传图来。 鉴定染色体上特异的DNA片段，进行基因定位和分离 RAPD易发现多态性，敏感性高。可找出与靶基因连锁的RAPD标记，进行基因定位。 生命经纬 www.biox.cn

AFLP(Amplified Restriction fragment polymorphism) 瑞士Zabeau等1992年发明 结合了RFLP和PCR技术的特点，具有RFLP技术的可靠性和PCR技术高效性。 基本原理：对基因组DNA进行酶切，连上双链人工接头，根据接头的核苷酸序列和酶切位点设计引物，进行选择性扩增。 它将RAPD随机性和专一性扩增巧妙结合，再选用内切酶以达选择的目的。 生命经纬 www.biox.cn

三个步骤 (1)DNA酶切及人工接头连接，对提取DNA质量要求较高，需避免其它DNA污染和抑制物质的存在； (2) 扩增反应； (3) 通常在4％-6％的变性聚丙烯酰胺凝胶上分离 生命经纬 www.biox.cn

特点 --理论上，可以采用的限制性内切酶及选择碱基的种类、数目很多，所以标记数目是无限的。 --每次谱带在50-100条之间，多态性检测非常有用 --呈典型的孟德尔方式遗传 --可用于作为遗传图谱和物理图谱的位标。 --可用于分析基因组DNA、克隆的DNA大片段， —对模板浓度不敏感，即使模板浓度存在差异，也会得到强度一致的谱带。 生命经纬 www.biox.cn

需要同位素或非同位素标记引物，须具特殊防护措施、配套仪器设备 缺点 专利技术，试剂盒价格贵 需要同位素或非同位素标记引物，须具特殊防护措施、配套仪器设备 基因组的不完全酶切会影响实验结果，所以实验对DNA纯度和内切酶的质量要求较高。 生命经纬 www.biox.cn

继RFLP之后的第二代分子标记 多态性好、重复好、共显性标记 SSR（ Simple sequence Repeat ） =(microsatellite) =(Short Tandem Repeat,STR) Satellite DNA：真核生物基因组酶切、离心后，在 主带附近会出现（AT）含量很高的简单高度重复序列。 Microsatellite DNA：一类由几个核苷酸（一般1-5个，基序很短）为重复单位串联而成的DNA序列。 继RFLP之后的第二代分子标记 多态性好、重复好、共显性标记 生命经纬 www.biox.cn

微卫星DNA广泛存在：人和动物（TG）n， 植物（AT）n 微卫星DNA长度的多态性 微卫星DNA两端多是高度保守的单拷贝序列 原理 特点 微卫星DNA广泛存在：人和动物（TG）n， 植物（AT）n 微卫星DNA长度的多态性 微卫星DNA两端多是高度保守的单拷贝序列 原理 根据两端序列的保守性，设计引物；进行 PCR，电泳分离，染色显带以检测微卫星序 列多态性。 生命经纬 www.biox.cn

applications 构建遗传连锁图 种质资源鉴定 标记辅助育种 基因诊断与治疗：一些人类基因病的产生与三核苷酸重复序列动态有关。 生命经纬 www.biox.cn

其他 简单序列重复区间（Inter-simple Sequence Repeat, ISSR) 序列标记位点（Sequence-Tagged Sites,STS) 小卫星DNA（Minisatellite DNA) 单链构型多态性（Single-strand Comformation Polymorphism,SSCP) 变性梯度凝胶电泳（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,DGGE) 生命经纬 www.biox.cn