动植物检验检疫实验

实验一 凝集反应 【实验目的】 　　1．了解凝集反应的原理、基本类型及其临床意义。 　　2．掌握玻片凝集实验、间接凝集实验的实验方法和结果分析。

　　在一定浓度的电解质溶液中，颗粒性抗原与相应抗体结合后，出现肉眼可见的凝集块，称为凝集反应。凝集反应是一种定性的检测方法，也可以进行半定量检测。凝集反应可分为直接凝集反应和间接凝集反应。

玻片凝集试验——ABO血型鉴定 　　玻片凝集试验为定性试验，一般用已知抗体作为诊断血清，与受检颗粒抗原，如菌液或红细胞抗原各加一滴在玻片上，混匀，数分钟后即可用肉眼观察凝集结果，出现凝集颗粒的为阳性。此法简便，快速，适用于从病人标本中分离得到的菌种的诊断或分型，也可用于红细胞ABO血型的鉴定。

【实验原理】 　　人类ABO血型抗原主要有A和B两种，根据红细胞表面这两种抗原的有无可把血型分为四种。据此，将抗A和抗B抗体分别与待测红细胞混合，抗A或（和）抗B抗体与红细胞表面上的相应抗原结合而引起红细胞凝集，据其凝集情况便可判定出受试者的血型。 　　　　　　ABO血型的划分 红细胞表面Ag 血清中Ab A型 A 抗B B型 B 抗A AB型 A、B —、— O型 抗A、抗B

【实验材料】 　　1．ABO血型鉴定试剂盒　内含抗A分型试剂和抗B分型试剂各1支。 　　2．一次性采血针1枚、洁净玻片2块、75％酒精、灭菌棉签。 　　3．84消毒液

【实验方法】 1．取洁净载玻片1块，并标记（如图） A B 抗A 抗B 2．将抗A、B分型试剂分别加1滴于标记有A、B的玻片两侧。

3．用酒精棉签消毒被检者手指尖端，以采血针刺破皮肤，稍加挤压，使血液流出。用另一载玻片一端取适量血液加入抗抗A分型试剂，并混匀；用另一端再取适量血 液加入抗抗B分型试剂，并混匀。用干棉签止血。

4．观察红细胞有 无凝集发生。如 有凝集，可见红 细胞凝集成块； 无凝集，红细胞 呈均匀分散。判定结果后把玻片放入消毒液中。

记录受检者红细胞凝集情况，根据ABO血型鉴定表(下表)，判断受检者的血型。 【实验结果】 　　记录受检者红细胞凝集情况，根据ABO血型鉴定表(下表)，判断受检者的血型。 　　　ABO血型鉴定表 抗A分型试剂侧 抗B分型试剂侧 血型 + — A B AB O “＋”表示红细胞凝集，“－”表示红细胞未凝集

【思考题】 什么叫凝集反应?直接凝集试验和间接凝集试验各有何特点？各有何实际意义（用途）？

实验二 沉淀反应 【实验目的】 1．了解沉淀反应的原理、基本类型及其在动植物检验检疫中的意义。 实验二 沉淀反应 【实验目的】 1．了解沉淀反应的原理、基本类型及其在动植物检验检疫中的意义。 2．熟悉琼脂单向扩散的基本原理、方法、结果分析及用途。

【实验原理】 在含有特异性抗体的琼脂板中打孔，并在孔中加入适量的抗原，当抗原向周围扩散后与琼脂中抗体相结合，即形成白色沉淀环，其直径或面积与抗原浓度成正相关。

【试剂与器材】 1. 人IgG干粉。 2.羊抗人IgG免疫血清。 3. 1.5%食盐琼脂。 4. 水浴锅、载玻片、打孔器、微量加样器等。

【操作方法】 1. 配制生理盐水琼脂 2. 制备特异性抗体的琼脂板 3.用直径3mm打孔器在琼脂板上打孔，孔间距为1.2～1.5cm。 4.向上排各孔分别加入人血清蛋白（用生理盐水稀释）,每孔加10μl。 5.把已加样的琼脂板置于湿盒内37℃温箱培养，24小时后观察结果。

单向琼脂扩散(平板法） 抗体+琼脂 抗原 沉淀环

【实验结果】 24小时后,观察结果并作记录. 【思考题】 什么叫沉淀反应?单向琼脂扩散和双向琼脂扩散各有什么特点？各有何实际意义（用途）？

实验三 植物病原真菌的分离培养以及临时玻片的制备

一、实验目的 1. 学习植物病原真菌分离培养的原理和常用的方法。 2. 初步掌握临时玻片的制备以及绘制病原菌草图技术

关于柯赫氏证病法则 (Koch′s postulate) 　　1882年，柯赫(Koch)在研究了人和动物的病害之后，提出了确定一种微生物致病性的三个必要条件：(一)这种微生物经常与某种病害有联系，发生这种病害往往就有这种微生物存在；(二)从病组织上可以分离得到这种微生物的纯培养，并且可以在各种培养基上研究它的性状；(三)将培养的菌种接种在健全的寄主上，可诱发出与原来相同的病害；史密斯(Smith)在1905年又补充以下一条，(四)从接种后发病的植物上，能再分离到原来的微生物。　

二、植物病原菌分离培养的原理 和常用的方法 1. 植物病原菌分离培养的原理 采用组织分离法或稀释分离法将某种特定的病原微生物与混杂在一起的其他微生物分开，并将其接种于营养适宜的基质中培养，获得这种纯培养物。

植物病原菌分离培养的常用的方法 病原菌分离的方法因材料不同而异，植病实验室最常见的方法有组织分离法和稀释分离法两种。 　　1、组织分离法：这种方法适用于大部分病菌的分离，此法又分为小块组织分离和大块组织分离两种方法。

操作步骤： # 培养皿的准备 # 培养皿平板制作 # 切取病组织小块 # 表面消毒 # 用无菌操作法将病组织小块移至培养基平面上，每皿放3—4块 # 翻转培养皿，放入26-28℃恒温温箱内培养，3-4天后观察结果 # 选择菌落移至斜面保藏并制片镜检

2.稀释分离法： 稀释分离法适用于细菌、土壤菌及产生孢子多的真菌等病原菌的分离.

3、划线分离法

b平板划线分离法

4. 点植法 在放大镜的观察下，用无菌镊子夹取一段待分离的真菌菌丝成一个孢子直接放在平板上作分离培养，即可获得该种真菌的纯培养。

三、临时玻片的制备方法 临时玻片的制备方法很多，如涂、撕、粘、挑和切片等等，可根据病原物的类型选择使用。 1. 涂抹法 2. 撕取法 3. 粘贴法 4. 挑取法 5. 组织透明法 6. 徒手切片法 录像

四、实验材料 病组织材料：霉变大米 　　瓶装马铃薯琼脂培养基； 　　此外，还有以下备品，无菌水1瓶，灭菌培养皿，灭菌1毫升吸管2支，解剖剪、解剖刀和镊子各1把，移植环，移植钩、酒精灯、载玻片、显微镜和试管架各1个，毛巾1条，玻璃铅笔1支及火柴等。

五、操作步骤 1、划线法分离病原真菌 （1）取琼脂培养基融化，冷却至45℃，注入无菌平皿中，每皿15-20毫升，做成平板待用。 （2）取要分离的材料（如孢子、麸曲、混杂的或污染的真菌培养物）少许，投入盛有无菌水之试管内，振摇，使分离菌悬浮于水中。 （3）将接种环经火焰灭菌并冷却后，沾取上述悬浮液，进行平板划线。 （4）划线完毕，置温箱中培养2-5天，钓取单个菌落的部分，制片检查。若只有一种菌生长，即得纯培养。如有杂菌可取培养物少许制成悬液，再作划线分离，有时须反复多次，才得纯种

2、临时玻片的制备方法 1）. 涂抹法 将被检物悬浮物均与地涂抹在清洁的载波片上，直接观察或在酒精灯火焰上烘干、固定、染色后观察。 2） 粘贴法 将塑料胶带纸剪成边长5mm左右的小块，使胶面朝下贴在病部，轻按一下后制成玻片，镜检。 3）挑取法 用挑针在病组织或基物上挑取表面的霉状物、粉状物或孢子团制成玻片观察。

六、作业 1分离植物病原菌常用的方法有几种? 怎样分离? 1分离植物病原菌常用的方法有几种? 怎样分离?　　 2试分析分离工作成败的原因。 3 根据自制临时玻片观察到的现象，绘制真菌典型特征图，并注明名称。

实验四 显微玻片标本的制作

实验四 显微玻片标本的制作 散开，然后小心地盖上盖玻片，注意不要产生气泡。置显微镜下先用低倍镜观察，必要时再换高倍镜。 注意事项： 一、实验目的 掌握制作永久装片基本方法，并完 成相应真菌结构的显微镜观察。 二、实验材料和用具 霉菌培养平板、载玻片、盖玻片、 解剖针、蒸镏水、吸水纸、剪刀、 镊子、光学显微镜、染色液、乳酸 石炭酸棉兰染色液（玻片浮载 剂）、明胶石炭酸封片剂等。 三、方法 1.明胶石炭酸封片剂的配制： 明胶 10.0g 石炭酸 28.0g 冰醋酸 28.0mL 石炭酸溶于冰醋酸中，加明胶，不加热任其溶化，最后滴加甘油10d搅拌即可。如果太干燥则可加入冰醋酸。 2.制片 于洁净载玻片上，滴一滴乳酸石炭酸液于载片中央，用解剖针从霉菌菌落的边缘处取小量带有孢子的菌丝置于液滴中，再细心地将菌丝挑 散开，然后小心地盖上盖玻片，注意不要产生气泡。置显微镜下先用低倍镜观察，必要时再换高倍镜。 注意事项： 挑菌和制片时要细心，尽可能保持霉菌自然生长状态。 加盖玻片时切勿压入气泡，以免影响观察。 3. 封片 经显微镜下先用低倍镜观察，再换高倍镜观察后，形态结构典型的片子，用滴管吸取少量封片剂封片。 四、作业 根据观察的形态绘图。 制片时的注意事项有哪些

第二章 生物玻片标本制作技术 第一节 生物玻片标本制作方法 第二节 植物材料玻片标本制作技术 第三节 动物材料玻片标本制作技术

第一节 生物玻片标本制作方法 一、切片法 1.徒手切片法 从保存时间长短分，有临时玻片标本和永久玻片标本。从制作的方法 第一节 生物玻片标本制作方法 从保存时间长短分，有临时玻片标本和永久玻片标本。从制作的方法 来分，有涂片、压片、装片(也叫整装法)、磨片和切片等 。 一、切片法 切片法即用刀片将材料切成薄片的方法。 1.徒手切片法 简单、省时、容易掌握，有一定局限性，但至今在生物学教学中仍然是观察形态构造的一种基本切片方法 。 （1）材料和夹持物 （2）材料的持法 （3）持刀方法 （4）切片 （5）取片 （6）选片、装片

材料和夹持物 【图片说明】 可多切一些标本，以便从中选取较好的进行观察。 切取的标本

放置标本 滴水 加盖盖玻片 叶的横切

所使用的支持剂是石蜡，优点是切下的片子薄而匀，还能作连续切片，但制作手续较复杂 。 2.石蜡切片法 所使用的支持剂是石蜡，优点是切下的片子薄而匀，还能作连续切片，但制作手续较复杂 。 几个重要环节步骤如下： (1)固定 其目的在于保存组织中各细胞的形态结构和生活时相似；必须对固定液的选择、固定材料的性质、大小和固定的时间以及研究的目的等加以注意。 (2)冲洗 (3)脱水 酒精是最常用的脱水剂，把酒精配成不同梯度的浓度缓慢进行。 (4)染色 (5)浸蜡 将已透明的材料投入熔化的石蜡中，取代透明剂，使组织中空隙为石蜡透入而填满；

(6)切片 用石蜡包埋块包埋的石蜡块，经修整后一般使用旋转式切片机进行切片； (7)透明 透明在两种情况下进行。 第一，透明是在组织脱水后浸蜡前进行，其目的不在于为了显微镜观察，而是作为从脱水剂进入包埋剂的桥梁。因此，透明剂必须既能与酒精混合，又能与石蜡融合无间，二甲苯即具此性质，故被选为常用的透明剂。 第二，透明是在片子脱水与封藏之间进行。其目的除了作为从脱水剂进入封藏剂的桥梁外，尚有使标本透明而便于观察的作用。 (8)封藏 常用的封藏剂有树胶和甘油等。封藏的目的在于使切片能永久保存便于镜检。

3.火棉胶切片法 火棉胶切片法所使用的支持剂是火棉胶。这种方法的优点是包埋过程不经高温，可以避免组织收缩及变脆，适用精细材料(如脑)的切片，也因火棉胶有韧性，切片不致有折卷或破裂，适于大块组织及多空洞的组织(如脑、眼球)的切片 。 4.冰冻切片法 冰冻切片法是将已固定或新鲜组织块不经脱水和包埋先进行冰冻，然后在切片机上切片的一种方法。这种方法的优点是：1.制片速度快，因此常用于临床上的病理手术诊断；2.能保存组织内某些易被有机溶剂所溶解的物质，例如脂肪和酶等。 同时还可以防止组织块的收缩保持原形。缺点：所切片子较厚，又不能作连续切片还有易碎的毛病。

二、非切片法 1.涂片法 是一种将游离的细胞，动、植物中比较疏松的组织均匀地涂布在载玻片上的一种制片方法。涂片材料有单细胞生物、小形藻类、血液，含有细菌的培养液以及精巢、花药等 2.压片法 将植物或动物比较疏松的材料，如花药、根尖、水螅，蠕虫的精巢、果蝇(或其他双翅目)幼虫的唾液腺等，用较小的压力压碎在载玻片上使成一薄层的一种制片法。   3.装片法 微小的生物如衣藻、水绵、青霉、变形虫和水螅等可以直接作为装片的材料植物的叶表皮、鳞茎表皮等；动物中如昆虫的翅、腿、口器等；人的口腔上皮细胞等都是从整个器官上取其一部分作为装片材料，可制作成临时或永久装片，进行观察。

4.悬滴法 悬滴玻片是将培养在盖玻片上溶液里的活材料(如变形虫的运动、细菌的活动、花粉的萌发等)封闭在载玻片的小室里，供观察它们活动的一种玻片标本。 5.磨片法 一些含有矿物质的比较坚硬的动物组织要作成玻片标本时，常把材料直接放在砂石上磨成薄片，此法即为磨片法。如珊瑚的骨骼、软体动物的贝壳，脊椎动物的硬骨、角以及牙齿等都可以用此法制成玻片标本。

第二节 植物材料玻片标本制作技术 一、常用实验种子植物的制片方法 (一)洋葱表皮装片 (二)洋葱根尖纵切片(示细胞有丝分裂) 洋葱表皮细胞 第二节 植物材料玻片标本制作技术 一、常用实验种子植物的制片方法 (一)洋葱表皮装片 (二)洋葱根尖纵切片(示细胞有丝分裂) 洋葱表皮细胞 洋葱根尖细胞

(三)蚕豆根横切片 (四)南瓜茎纵切片及横切片 蚕豆幼根横切 南瓜茎纵切片

二、常用实验孢子植物的制片方法 (一) 衣藻装片 (二) 团藻装片 衣藻装片 团藻装片