分子生物学与临床 PCR技术及其应用 中 山 大 学 主讲：杨 中 汉 （yangzhonghan@163.com）
目 录 PCR的概念 PCR技术的创建 PCR的原理 PCR的反应体系和方法 PCR的类型和应用
多聚酶链式反应 （PCR：Polymerase Chain Reaction) Polymerase: DNA聚合酶
基因组DNA 引物 DNA聚合酶 DNA片段体外扩增
PCR技术的创建 Kary B. Mullis（穆利斯（美）） Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。 1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。 1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术 1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。
Kary B. Mullis（1944－） http://www.karymullis.com
三篇重要论文 The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction (Scientific American, 1990,262(4):56-61, 64-5 ) Primer-directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase (Science,1988,239(4839):487-91 ) Specific Synthesis of DNA In Vitro via a Polymerase Catalyzed Chain Reaction (Methods in Enzymology, 1987,155:335-50 )
PCR技术诞生所依赖的社会需求和研究需要 生物样品 DNA片段 基因诊断 基因治疗 基因工程产品 法医学检测 人类学研究 ……
基因组DNA 获取特定DNA片段 扩增特定DNA片段
基因组DNA文库 DNA文库 基因组DNA 限制性内切酶裂解 20kB fragments 基因重组 插入噬菌体载体 体外包装 转化细菌 细菌扩增 DNA文库
从基因组文库中筛选目的基因 probe 放射性核素 标记 转印 裂解变性 显影
DNA克隆 目的基因 扩增 宿主细胞 复制子 扩增 载体 提取DNA分子
DNA聚合酶 引物 引物 M13噬菌体 Sanger的测序技术 引物 DNA聚合酶 1977年
DNA聚合酶 引物 Mullis的构思 1983年 引物 DNA聚合酶 特定DNA片段
94℃变性 50-65℃退火 XX℃延伸
94℃ 55℃ 37℃
1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术 Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 100 80 60 40 20 酶活性(%) 40 50 60 70 80 90 100 温度(℃)
94℃ 55℃ 72℃ PCR循环
PCR技术的原理 1 PCR技术的基本原理 无细胞分子克隆法：在微量离心管中,加入适量的缓冲液, 微量的模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶, 一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍; 扩增了特异区段的DNA带。
复习 5’ 3’ DNA聚合酶 dNTP 解旋酶类 引物 体内DNA的复制
DNA的变性和复性 加热或强酸、碱性作用可以使 DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为 DNA的变性。 变 性 复温 DNA的变性和复性
引物 5’ 3’ 3’ 5’ 变性、退火 延伸 变性、退火 延伸 PCR扩增原理
2 PCR技术的特点 1 ）高度的灵敏性 PCR产物每轮循环增加一倍 30轮循环 扩增量达230个拷贝（109拷贝）
2 ）特异性 引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。 引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。
引物设计： （1)序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列。 （2）引物长度以15-40 bp为宜。 （3）碱基尽可能随机分布,G+C占50-60%。 （4）引物内部避免形成二级结构。 （5）两引物间避免有互补序列。 （6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。
3’ 5’ 5’ 3’ 限制性内切酶的识别序列 启动子序列 定点突变 探针标记
3）操作简便易行 PCR扩增法,只需要数小时,就可以用电泳法检出1μg基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列。 通常的DNA 扩增法是分子克隆法, 首先要构建含有目的的基因的载体, 然后将它导入细胞后进行扩增,还要用同位索探针进行筛选;这种方法,要经过DNA内切、连接、转化和培养等相关的过程,操作复杂,一般需要数周时间。
目的基因 扩增 宿主细胞 复制子 扩增 载体 提取DNA分子
4 ）用途广泛 生命学科 医学工程 遗传工程 疾病诊断 法医学 考古学
PCR的反应体系和方法 PCR管加热使模板变性, 退火使引物与模板DNA互补,延伸需将反应温度升至中温( 72℃),在Tap多聚酶的作用下,以dNTP为原料,以引物为复制的起点,合成新链。 如此重复改变反应温度,即高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍; 将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。
1 反应体系 总体积 50-100 l Buffer 缓冲液 dNTP 原料 Primer 引物 DNA分子 模板 Taq酶 DNA聚合酶
2 基本过程 PCR技术的基本过程(1) TaqDNA聚合酶 预变性 模板DNA dNTP 模板DNA dNTP 引物 引物 Buffer 94oC5’ PCR技术的基本过程(1)
PCR技术的基本过程(2) 循环仪 72 ℃ 5～7 min 94℃ 55 ℃ 72 ℃ Taq 酶 Taq 酶 模板DNA 模板DNA dNTP 引物 Buffer Taq 酶 模板DNA dNTP 引物 Buffer 94℃ 55 ℃ 72 ℃ 循环仪 循环25～35次 PCR技术的基本过程(2)
琼脂糖凝胶电泳 PCR技术的基本过程(3)
3 PCR反应条件 1）PCR反应成分 （1）模板 单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 一般100ng DNA模板/100L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。
（2）引物浓度 0.1-0.5 mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。 （3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 0.5-2.5 U/50 l 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。
（4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。
（5） Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。 0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。 Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。
2）循环参数 变性 使双链DNA解链为单链 94oC 20-30秒 (2) 退火 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。
（3）延伸 （4）循环次数 70-75℃,一般为72℃ 延伸时间由扩增片段长度决定 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加
经典循环参数（500bp以内） ×30次 94℃ 5min 94℃ 30s 55 ℃ 45s 72 ℃ 1min 72℃ 7min 42℃ forever
PCR的类型 1）不对称PCR 目的：扩增产生特异长度的单链DNA。 基因组DNA结构功能的研究 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针 基因组DNA结构功能的研究
高浓度引物 低浓度引物
2)反向PCR (reverse PCR) 是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。 已知序列 未知序列 未知序列
限制酶 限制酶 已知序列 未知序列 未知序列 连接酶
3）多重PCR（复合PCR） 用于检测特定基因序列的存在或缺失。
引物 1 2 3 4 4 3 2 1 电泳
DMD：人类肌营养不良基因 A：无外显子8,12,17,19对应条带,说明病人外显子8～19缺失 B：病人A中未扩增外显子带的强度为C的一半,提示为区域缺失携带者 C：正常人DMD基因外显子的一般扩增形式 多重PCR检测DMD基因缺失
4）LP-PCR（Labelled primers) 利用同位素、荧光素等对ＰＣＲ引物进行标记,用以直观地检测目的基因。 特别适合大量临床标本的基因诊断 可同时检测多种基因成分 病毒1 病毒2 病毒 3 病毒4
标记引物 ＰＣＲ PCR产物 观察
5）锚定PCR（anchored PCR, A-PCR） 对于未知序列和具有不同末端序列怎么办？
VH VH VL VL CH1 CH1 CL CL CH2 CH2 CH3 CH3
锚定PCR首先合成第一链cDNA,然后再添加一同聚物尾（polydG),与同聚物尾配对的3’锚定引物（带有限制性内切位点polydC)一起作PCR扩增 末端核酸转移酶 5’ 3’GG…GG CC…CC 锚定引物 3’GG…GG 5’ CC…CC 3’GG…GG CC…CC
6）PCR固相分析法 亲和固相介质 模板 生物素化引物 探针 PCR扩增 检测探针信号 可用于基因芯片的制作
7）原位ＰＣＲ 适用于检测病理切片中含量较少的靶序列 原位聚合酶链式反应（In Still PCR,Is－PCR）是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。 直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行ＰＣＲ扩增。可进行细胞内定位。 适用于检测病理切片中含量较少的靶序列
原位PCR的作用 既往鉴定细胞内特异序列一般采用原位杂交（ISH）,但在每个细胞中目的片段的拷贝数少于10的情况下,该方法的敏感度就明显下降。而标准的PCR则可扩增出细胞内单拷贝的序列,敏感度很高,但却未能与细胞形态学研究相结合。 ISPCR则可把这两者结合起来,成为细胞学诊断中一种崭新的检测技术。利用该法可检测细胞内病毒感染、细胞内基因重排、以及分析细胞内RNA表达产物等方面发挥一定作用。在检测细胞的潜在感染方面也具有重要意义。
1. 细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入 操作步骤 1. 细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入 2. PCR扩增细胞内目的片段 3. 原位杂交检测扩增产物 A.阳性对照 B.阴性对照 C.原位检测mRNA表达
8）ＲＴ－ＰＣＲ mRNA 逆转录酶 杂化双链 ＤＮＡ聚合酶 cDNA PCR扩增
基因 mRNA 蛋白质多肽链
9) 荧光定量 PCR（real-time PCR) 光定量PCR仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系统的PCR仪,通常配有电脑系统及相应的分析软件。
荧光标记
荧光定量PCR标记方法 内掺式染料 SYBR Green I 序列特异性探针 Taqman Molecular Beacons Dual Probes(FRET) 引物特异性探针 Amplifluor (Intergen)
Excitation SYBR-Green I 5’ 3’ Emission SG SG SG SG SG
SYBR-Green I Excitation Emission SG SG 5’ 3’ SG SG SG
荧光能量传递技术(fluorescence resonance energy transfer , FRET) Taqman探针3′端Q荧光分子能够吸收5′端R荧光分子发出的荧光,因此,正常情况下该探针检测不到5′端荧光分子发出的荧光,只能检测到3′端荧光分子的荧光信号,但当溶液中有PCR 产物(模板) 时,探针与模板退火,即产生了适合于核酸外切酶活性的底物,从而激活Taq 酶的5′外切酶活性,将探针5′端连接的R荧光分子从探针上切割下来,破坏了两个荧光分子间的FRET ,从而发出荧光,切割的R荧光分子数与PCR 产物的数量成比例,因此,根据PCR 反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量 荧光能量传递技术(fluorescence resonance energy transfer , FRET)
荧光共振能量传递（FRET Probe） Emission Excitation Oligo 1: Fluorescein Oligo 2: LC Red 640 Transfer
双标记探针（Taqman Probe） 5’ 3’ Excitation Excitation 5’ 3’ Q R R R Q Q R Q
分子信标（Molecular Beacon Probe） Emission R Q Excitation Excitation R Q Q R X
引物特异性探针（Amplisenor Probe）
引物特异性探针（Amplifluor Probe） 5’ R Q R Q R Emission 5’ 3’ R Q 3’ 3’ R Excitation R Q 5’ 3’ 5’ Q R
荧光定量实时PCR与普通PCR的比较 实时在线监控 对样品扩增的整个过程进行实时监控,能够实时地观察到产物的增加,直观地看到反应的对数期 降低反应的非特异性 使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合,提高了PCR反应的特异性 增加定量的精确性 全程监控,准确的算法进行定量 结果分析更加快捷方便,无需跑胶
普通梯度PCR仪 全新4通道实时荧光定量PCR仪
PCR技术的应用 1) 基因克隆 质粒DNA 基因片段 重组DNA
基因工程产品 胰岛素 + 胰岛素基因 重组体 大肠杆菌
Bam H I 5’ 5’ Bam H I Bam H I Bam H I
目的基因 限制性核酸内切酶 质粒DNA CCTG GGAC GTCC CAGG GGAC GTCC CAGG CCTG GGAC CAGG
2)基因检测 内源性病变基因 正常人 A 病 人 A’ 病原微生物基因 正常人 (-) 病 人 (+)
遗传病的诊断 地中海贫血 基因缺失、插入或置换等 珠蛋白链合成不平衡
正常人 病 人 A 正常 病人
PCR-ASO检测基因点突变:主是利用PCR技术扩增靶基因的适当片段,然后用人工合成的含突变位点的标记寡核苷酸探针杂交 病人 C 正常 T ASO探针 G
NC膜 探针 探针杂交 正常人 突变纯合子 突变杂合子
恶性肿瘤（癌基因或抑癌基因） PCR-RFLP法： Ras基因 限制性内切酶
突变 限制性内切酶
正常 突变 电泳
3)基因配型 HLA系统基因分型 PCR-SSP PCR-RFLP法 PCR-SSO法 PCR-SSCP
PCR-SSP 引物特异性 （序列特异性引物-PCR技术 ） 1 2 3 4 5 6 7 8 PCR 1 2 3 4 5 6 7 8
4）基因鉴定 女性 男性 PCR Y引物 男性 女性
法医学分析 个体识别、亲缘鉴定 方法：PCR-RFLP DNA遗传指纹 PCR-ASO PCR-VNTR多态性 PCR-SSCP
PCR-VNTR多态性检测 （VNTR：数目可变的串联重复序列 ） PCR；电泳检测
父’ 父 子 母
现 嫌1 嫌2 嫌3
思考题: 1)从PCR的基本原理和特点, 论述其应用价值.