(Real time Quantitative PCR)

讲 座 提 纲 实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR医学和科研中的应用 实时荧光定量PCR原理 讲 座 提 纲 实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR医学和科研中的应用 实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR医学和科研中的应用

实时荧光定量PCR定义 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法

实时荧光定量PCR 原理 实时原理 对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析 常 规 PCR技术： 无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测 实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析

实时荧光定量PCR原理 定量原理 如何对起始模板定量？ 介绍三个概念： 扩增曲线、荧光阈值、Ct值

实时荧光定量PCR 原理 ----------- 扩增曲线 扩增曲线图： 横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集 荧光基团 荧光检测元件

实时荧光定量PCR 原理 -------荧光阈值 荧光信号阈值 （threshold ）： 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值 荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 手动 设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99 真正的信号:荧光信号超过域值

实时荧光定量PCR 原理 -------Ct值 C(t) value

实时荧光定量PCR 原理 -------Ct值的重现性 纵轴：荧光信号量 Ct值的特点： 相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； Ct值则极具重现性

实时荧光定量PCR 原理 --------- 定量原理 X=X0*2n 非理想的PCR反应： X=X0 (1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率

实时荧光定量PCR 原理 --------- 定量原理 在扩增产物达到阈值线时: XCt=X0 (1+Ex)Ct =M (1) XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量. 在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M 方程式(1)两边同时取对数得: log M=log X0 (1+Ex)Ct (2) 整理方程式(2)得: log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log M (3) Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量

实时荧光定量PCR 原理 --------- 标准曲线 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小 Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量

实时荧光定量PCR原理 绝对定量 确定未知样品的 C(t)值 通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量 Sample 25

讲 座 提 纲 实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR实验设计及应用 实时荧光定量PCR原理 讲 座 提 纲 实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR实验设计及应用 实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR实验设计及应用

实时荧光定量PCR 原理 --------- DNA 产物的荧光标记 非特异性荧光标记： 1、 SYBR Green 特异性荧光标记： 2、TaqMan 3、Molecular Beacon 4、Amplisensor Q R

实时荧光定量PCR 方法 1 ---------SYBR Green 法

SYBR Green 法 工作机理 SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位 SYBR Green

实时荧光定量PCR原理 SYBR Green I 工作原理 5’ 3’ SG No Emission Excitation SG 5’ 3’ Emission Excitation

实时荧光定量PCR原理 SYBR Green I 熔解曲线分析 温度 荧光强度 Tm Tm值：DNA解链一半时的温度

实时荧光定量PCR原理 SYBR Green I 熔解曲线分析 -dI dT Tm 将温度与荧光强度的变化求导。(-dI/dT)

其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确 SYBR Green 法 融解曲线分析 融解曲线分析，单一峰 无非特异性荧光 定量准确 非特异性产物 融解曲线分析，出现杂峰 其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确

SYBR Green 法 定量原理 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少 Flourescenc Ck 102 Ck 104 Sample 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少 Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量 Cycle number Cycle number Log of DNA concentration

SYBR Green 法 ------------PCR反应的建立 反应体系的建立及优化: SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测 Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准 MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物 反应Buffer 体系的优化 反应温度和时间参数:由酶和引物决定 其他与常规PCR相同

天为时代公司利用SYBR Green 法定量检测样品DNA

SYBR Green 法 应用范围 起始模板的测定 基因型的分析 融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。

SYBR Green 法 优缺点 优 点 缺 点 对DNA模板没有选择性 ----适用于任何DNA 使用方便 -----不必设计复杂探针 非常灵敏 便宜 优 点 容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性 但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件 对引物特异性要求较高 缺 点

实时荧光定量PCR 方法2 -------TaqMan法 与目标序列互补 5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光 Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针

TaqMan法 工作原理 每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光

TaqMan 法 PCR反应的建立 1、引物、探针的设计： 探针Tm为68-70℃ ，<30 bp, 5’不能有G，G可能会淬灭荧光素， 引物尽量靠近探针，扩增片段<400 bp，引物Tm为59-60℃ 2、反应参数的确定： 一般为：94 ℃，10-20S 60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃ 最高） 也可通过温度梯度优化退火温度 72 ℃，45 S， 3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值 引物浓度：50-900nM 探针浓度：50-250nM 4、其他与常规PCR相同

利用TaqMan法 检测血液中的HBV 已肝病人血液中HBV的绝对定量 目的：利用核酸检测，缩短检验时间，提高灵敏度，为诊断用药提供依据 方法：从血液中提取病毒DNA，扩增病毒基因，以TaqMan探针进行检测 设置对照：浓度为106、105 、104 103 的标准样品各一个，设阴性和空白对照 实验步骤：提取HBV DNA 设计特异引物 设计TaqMan探针并标记探针 扩增程序 结果：获取血液样品中HBV DNA的精确copy数

分析结果： HBV DNA的精确copy数为3.7X105 利用TaqMan法 检测血液中的HBV 数据分析 分析结果： HBV DNA的精确copy数为3.7X105

TaqMan法 应用范围 起始模板的定量 基因型分析 目的基因定量 产物鉴定 SNP分析

TaqMan法 优缺点 优 点 缺 点 对目标序列的高特异性 ------阴性结果确定 设计相对简单 ------与目标序列某一区域互补 重复性比较好 优 点 只适合一个特定的目标 委托公司标记，价格较高 不易找到本底低的探针 缺 点

发夹型杂交探针 实时荧光定量PCR 方法 3------- Molecular beacon 法(分子信标) 标记荧光的发夹探针 环 茎 荧光素 淬灭剂 标记荧光的发夹探针 环与目标序列互补 茎由互补配对序列组成 发夹型杂交探针

Molecular beacon (分子信标) 工作原理 荧光共振能量转移（FRET） 探针与DNA杂交时产生荧光 -----变性过程：产生非特异性荧光 -----延伸过程：不产生荧光 ------退火过程：产生特异性荧光，检测荧光信号

Molecular beacon (分子信标) 应用范围 起始模板的定量 基因型分析 产物鉴定 SNP（单核苷酸多态性）分析

Molecular beacon (分子信标) 优缺点 高特异性：对目标序列 检测SNP最灵敏的试剂之一 荧光背景低 优 点 只能用于一个特定目标 设计困难 价格比较高 缺 点

讲 座 提 纲 实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR实验设计及应用 实时荧光定量PCR原理 讲 座 提 纲 实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR实验设计及应用 实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR实验设计及应用

实时荧光定量PCR法 标准样品 绝对定量的标准样品： 已知拷贝数的质粒DNA和体外转入的RNA 相对定量中的内标 内标通常是β-actin、GAPDH基因等看家基因 在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小 内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量

实时荧光定量PCR法 标准样品DNA拷贝数 用于生成标准曲线的样品如何设定？ 含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒 含有和待测样品相同扩增片段的cDNA 紫外分光光度计或荧光酶标测定浓度 根据质粒或cDNA分子量换算成拷贝数，做系列稀释

实时荧光定量PCR法 定量方法 绝对定量检测起始模板数的精确拷贝数，通常用到标准曲线 相对定量确定经过不同处理的样本目标转录本之间基因的表达差异（不同时相） 2-△C（t） 双标准曲线法

实时荧光定量PCR法 TaqMan法举例 TaqMan法研究ERBB2 在乳腺肿瘤 组织标本中的表达差异

TaqMan法举例 标记探针 使用 TaqMan 探针进行双通道荧光定量 Fam标记目标基因探针 VIC标记看家基因探针

TaqMan法举例 材料准备 从正常乳腺组织中提取的总 RNA 从乳腺癌组织中提取的 总RNA 含 ERBB2 and GAPDH 的质粒用于生成标准曲线 单双通道同时进行，独立分析 Controls no RNA：阴性对照 RNA + no reverse transcriptase：基因组对照

TaqMan法举例 反应程序 RT-qPCR 反应程序： 50ºC,30min 95ºC,15min 94ºC,15sec plate read 10ºC,forever End 35 more times

TaqMan法举例 癌症标记物表达 Color 1 – FAM detection for ERBB2 Color 2 - VIC detection for GAPDH

TaqMan法举例 实验结果 单双通道相互验证 A.Multiplex Reactions Healthy RNA Carcinoma 28.48 26.42 28.68 26.98 28.78 28.65± 0.15 26.80 ± 0.32 B.Singleplex reactions 28.67 27.09 28.71 26.68 28.73 26.70 28.70 ± 0.03 26.82 ± 0.24

TaqMan法举例 实验结果 定量 Healthy RNA Tumor Tumor/Healthy ERBB2 1095 1052 2130 Copies ng/ µl Total RNA Healthy RNA Tumor Tumor/Healthy ERBB2 1095 1052 2130 2492 2.16 X GAPDH 95500 85730 136000 130800 1.45 X

TaqMan法举例 实验结果 定量分析 ERBB2 copies / GAPDH copies 1095 / 95500 = 0.011 Copies ng/ µl Total RNA ERBB2 copies / GAPDH copies 1095 / 95500 = 0.011 1052 / 85730 = 0.012 Healthy RNA 0.0115 2130/136000 = 0.017 2492/130800 = 0.019 Tumor RNA 0.018 0.018/ 0.011 Graph

TaqMan法举例 实验结果 表达差异 ERBB2的表达差异 Relative Expression Healthy Tissue Carc. Tissue

通过RT-qPCR成功检测了ERBB2基因在不同组织的 表达差异；在乳腺癌组织中，ERBB2的表达量是正常水平的1.8倍 TaqMan法举例 实验结果 讨论 通过RT-qPCR成功检测了ERBB2基因在不同组织的 表达差异；在乳腺癌组织中，ERBB2的表达量是正常水平的1.8倍

(SGI) for GMO soy detection 实时荧光定量PCR法 SYBR Green I法举例 利用SYBR Green 1进行GMO定量 (SGI) for GMO soy detection

SYBR Green I法 GMO概念 转基因生物又称遗传修饰生物（Genetically Modified Organisms，GMO），是经基因工程技术改变基因组构成的生物，包括转基因植物、转基因微生物和转基因动物。

SYBR Green I法 GMO概念 1983年：首例转基因植物－转基因烟草 1986年：转基因植物首次进入田间实验 1994年：首例转基因植物产品－Flavr Savr 延熟保鲜转基因番茄进入市场 1996年－至今：转基因作物迅猛发展期

SYBR Green I法 检测方法 转基因生物包括了特异的核酸序列，调控序列、目标基因、报告基因 通过内源基因来对每个样品DNA进行定量（Normalization) 利用插入基因的定量来进行GMO含量检测

SYBR Green I法 材料准备 Roundup Ready 大豆（RTC公司，IRMM-41050-56） 普通非转基因大豆 从超级市场买来的下列食物用来作为测试样品： 大豆饼,豆制甜点 和两个牌子的大豆粉

SYBR Green I法 样品制备 标准品的制备:转基因成分含量分别为 0%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2% 和 5% 转基因大豆 实验样本 – 从含大豆成分的样本中提取DNA DNA from Standard/Sample PCR mix GMO primers TUBE 1 TUBE 2 Lectin primers

SYBR Green I法 引物设计 Lectin 扩增片段长度为318bp 其引物为： 正向：5’-GAC-GCT-ATT-GTG-ACC-TCC-TC-3’， 反向：5’-GAA-AGT-GTC-AAG-CTT-AAC-AGC-GAC-G-3’ EPSPS 扩增片段长度为356bp 正向：5’-TGG-CGC-CCA-AAG-CTT-GCA-TGG-C-3’ 反向：5’-CCC-CAA-GTT-CCT-AAA-TCT-TCA-AGT-3’

SYBR Green I法 △C（t）定量 %GMO △C（t） log A/B = logA- logB A: EPSPS GMO B: Lectin all bean A/B: %GMO

SYBR Green I法测GMO 数据收集与分析 标准曲线log%GMO对应△C（t）获得 熔解曲线分析，检测扩增产物 数据处理： C（t）EPSPS-C（t）lectin=△C（t） 处理条件： 假定两对引物有相同的扩增效率并且相互独立扩增。

SYBR Green I法测GMO 熔解曲线分析 熔解曲线 – Lectin 扩增 Tm = ~88.5oC 熔解曲线 – epsps 扩增 Tm = ~92oC

SYBR Green I法测GMO 实验结果1:标准曲线 不同转基因成分含量与Ct epsps做标准曲线 Cp4-epsps

SYBR Green I法测GMO 实验结果2: 样品的扩增曲线 Lectin epsps Food Sample #2 Food Sample #1

SYBR Green I法测GMO 实验结果： 定量分析 Standards/ Sample C(t) epsps C(t) Lectin ND 22.6 0.1 0.5 28.2 22.5 1.0 27.2 2.0 26.2 22.8 5.0 24.6 22.7 Soy Dessert 22.4 Soy Flour 22.2 Soy Burger 24.2 23.4

SYBR Green I法测GMO 实验结果 定量分析 Calculate C(t) = C(t) epsps – C(t) lectin Standards/ Sample C(t) epsps C(t) Lectin ∆C(t) ND 22.6 0.1 0.5 28.2 22.5 5.6 1.0 27.2 4.7 2.0 26.2 22.8 3.4 5.0 24.6 22.7 1.9 Soy Dessert 22.4 2.1 Soy Flour 22.2 Soy Burger 24.2 23.4 0.7

SYBR Green I法测GMO 实验结果 标准曲线生成 根据C(t)值与标准品百分含量做标准曲线 y = -0.264x + 1.202 R 2 = 0.998 -0.40 -0.20 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1 3 4 5 6 ∆ C(t) Log percent GMO

SYBR Green I法测GMO实验结果 GMO定量 根据C(t)值标准曲线推算未知样本的转基因成分含量 Standards/ Sample ∆C(t) %GMO ND — 0.1 0.5 5.6 1.0 4.7 2.0 3.4 5.0 1.9 Soy Dessert 2.1 4.40 Soy Flour < 0.5 Soy Burger 0.7 > 5

SYBR Green I法测GMO 实验结果 讨论 用于转基因成分定量生成标准曲线的样品如何设定？ 阳性材料与阴性材料按比例混合成为不同转基因百分含量的标准品 分别提取DNA 紫外分光光度计或荧光酶标测定浓度，稀释至同一浓度

SYBR Green I法测GMO 讨论 PCR扩增效率 看两个反应是否具有相同的扩增效率的方法是： cDNA样品在100倍浓度梯度稀释后扩增产物△CT如何变化 斜率绝对值接近于0 为保证上述假定成立，即ExA= ExB 扩增子长度 引物设计 模板纯度、复杂度等 反应条件

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