第三章 重組DNA技術

重組DNA技術（recombinant DNA technique）又稱遺傳工程，在體外重新組合去氧核糖核酸（DNA）分子，並使它們在適當的細胞中增殖的遺傳操作。 這種操作可把特定的基因組合到載體上，並使之在受體細胞中增殖和表達。 因此它不受親緣關係限制，為遺傳育種和分子遺傳學研究開闢了嶄新的途徑。

DNA的剪切與接合 重組DNA分子若少了下列兩類酵素則無法 輕易地製備： 限制內切酶就像一把剪刀在特定專一位置 上剪切DNA分子

限制酶的命名是根據細菌種類而定，以EcoRI為例： Escherichia (屬) co coli (種) R RY13 (品系) I 首先發現 在此類細菌中發現 的順序

DNA限制片段的分離與觀察 瓊脂醣凝膠電泳是一種可以根據分子大小來分離DNA片段的技術。分離之後的DNA本身在膠體上是看不見的，經由溴化乙錠(ethidium bromide)的添加使得DNA泳動帶可以被觀察到。

DNA選殖 選殖的步驟包括： 分離DNA 把DNA接合到載體 把重組的DNA轉型到宿主細胞中 篩選含有重組DNA的宿主細胞 當蛋白質產物的宿主細胞

選殖載體 選殖載體的條件： 具有複製起點，DNA才可以在宿主細胞中進行複製。 必須相當小才能在純化過程中不經裂解就可以分離得到。 　使用，也因此載體將只被剪切一次，而且必須擁有許多 　可供插入DNA片段之限制酶作用位置可被利用。 具有選擇性的標記可以用來測定選殖媒介是否已轉移至 　細胞中或顯示外來的DNA是否已經插入至載體上。

細菌載體 質體(plasmids)： 質體具有多種的功能。有些可轉譯出一些提供對抗生素的抗藥性與細菌素～能抑制或殺死與其同類的細菌株或菌種等物質。另一些可提供生理上的功能，例如：色素的製造、化合物的裂解、雙氮的固定等。還有一些可以製造毒素且具有毒性的質體轉譯內毒素與溶血素，而有些質體則提供對金屬的抗性，例如汞、鎘、鎳、鋅。

噬菌體(bacteriophage) 可以感染細菌的病毒，我們稱之為噬菌體。病毒的DNA經由遺傳工程操作，已能當作選殖載體使用，最早被使用的是1974年的λ噬菌體。

其他生物體適用之載體 酵母人工染色體 細菌人工染色體 植物選殖載體 哺乳動物細胞載體

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細胞轉形 利用電穿孔技術的方式可以將外來的DNA分子送入原生質體中：原生質體暴露在短暫的電流脈衝下，細胞膜暫時打開，使DNA分子得以進入細胞，開始轉形。

電穿孔技術 將外源基因通過電場作用，導入動物目標組織或器官。 由於這種方法能有效導入外源基因，可在多種組織器官上應用,並且效率較高。 活體電穿孔法的原理很簡單,在直流電場作用的瞬間,細胞膜表面產生疏水或親水的微小通道105～115μm,這種通道能維持幾毫秒到幾秒,然後自行恢復。 在此期間生物大分子如DNA可通過這種微小的通道進入細胞。 近年來活體電穿孔法用於轉基因研究的報導不斷增多,在基因治療方面的優勢也日趨顯著,是一種很好的活體基因導入方法。

基因庫的建構與篩選 基因體基因庫 cDNA基因庫 篩選基因庫 表現基因庫

cDNA基因庫 利用一個只含有某型式細胞中已表現的基因所構成的基因庫，有時較為可行（例如：黃豆中屬於葉子專一的cDNA）。這種基因庫稱為cDNA基因庫，因為只表現基因體DNA的某一部分，大大地降低了DNA選殖的數量。

篩選基因庫

表現基因庫 表現基因庫(expression libraries)是由含有基因表現所需之調控元件，如：啟動子區域的選殖載體所組成的。

報導基因 在很多細胞中，報導基因已經被用來偵測許不同的生物體的基因表現（例如：植物、動物、魚和細菌），其他被利用的報導基因還包括：綠色螢光蛋白(green fluorescent protein, GFP)、β～葡萄糖醛酸酶(β-glucuronidase)基因。

南方墨點雜合法 南方墨點法(Southern blot)，是由英國生物學家E.M.Southern 發明，作用是來分析樣品裡是否有特定的DNA片段。

北方墨點雜合法 RNA取代了之前所提的DNA，利用類似於DNA轉漬的方法，也可將RNA從膠體轉移至濾膜上。北方墨點法用於確認所分離到的RNA與研究某特定基因的表現方面是相當有用的。

聚合酶連鎖反應法(PCR) PCR的應用使我們可以很快從所有DNA中分離出我們所要的特定基因或是其它的DNA區域，不須費時於基因庫篩選工作。 21

DNA 聚 合 酶 連 鎖 反 應 已 廣 泛 應 用 於 : 醫 學 診 斷 : 病 毒 感 染 偵 測 、 遺 傳 性 疾 病 診 斷 及 癌 症 研 究 如 致 癌 基 因 研 究 等 。 農 業 發 展 : 基 因 選 殖 、 基 因 重 組 等 生 物 技 術 、 動 植 物 病 蟲 害 防 治 等 。 族 群 遺 傳 學 : 自 DNA 遺 傳 的 多 態 性 (polymorphism) 及 其 序 列 變 異 程 度 來 追 溯 族 群 演 化 關 係 等 。 刑 事 科 學 : 核 酸 鑑 定 等

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DNA定序 在１９７７年，有兩種DNA定序方法首先被發表出來。哈佛大學A. Maxam與W. Gilbert發現一種可以選擇性分解鹼基的化學定序法。另一種由F. Sanger發展出來的DNA合成法（即試管中的複製作用），此定序法是利用在特定位置上終止剛合成的DNA鏈。在這兩個方法中，DNA都經過標記且利用凝膠電泳分離DNA片段，目前大多數的實驗室都使用Sanger的定序方法。 24

蛋白質分析法 蛋白質的相關研究在重組DNA技術領域中是相當重要的一環，因為它是科學家最終試圖進行量與序列上修飾的目標分子。 蛋白質凝膠電泳 蛋白質工程 蛋白質定序 25

蛋白質凝膠電泳 利用電泳可以根據蛋白質的大小與所帶電荷多寡將個別分子加以分離。 26

蛋白質工程 藉由蛋白質工程得到的改變包括： 增加穩定度、提高酵素活性、基質專一性的改變、改變酵素在極端條件下或非最適化的情況下的活性表現、提高營養價值。 27

蛋白質定序 1、Sanger’s法 2、氰酸化法 3、Edman割切法 4、PTH衍生物 5、差別分析 6、Dansyl-Edman步驟 7、蛋白質胜肽定序儀 8、Aminopeptidase的水解 9、羧基末端方法 10、Carboxypeptidase的水解

Edman發表了一種聚肽的順序切割法，這可能是目前蛋白質序列 分析中，最重要的技術。末端胺基酸的移除，是經兩個步驟完成 的。首先，胜肽在pH 8下，以異硫氰酸苯酯 (phenylisothiocyanate)處理，使末端胺基酸轉變為硫胺基碳酸 苯的衍生物(phynylthiocaibamyl derivate)(PTC-太胜)。第二 步是PTC-胜肽用無水的三氟醋酸(trifluoroacetic acid)處理， 催化末端胺基酸環化為Anilino-thiazolinone的衍生物。   五環的生成，是由於硫胺基酸上的硫原子，對第一個胜肽鍵上的 羰基作親質性的攻擊，伴隨環狀封閉的，是第一個和第二個胺基 酸間肽鍵的斷裂，在這種非水解狀況下，所有其他的肽鍵都保持 完整。末端胺基酸的anilino-thiazolinone若用有機溶劑，可以 從胜肽中萃取出來。胜肽中的胺基酸，如果有必要再進行切割， 可重複地偶合和環化，直到所有的胺基酸都被移除。 以Edman切割法逐步移除的胺基酸都被鑑定後，聚肽胺基酸順序 就被建立了。移除的胺基酸，可用環狀衍生物直接測定，或者用 胜肽與殘留的胜肽間胺基酸組成的差異間接測定。

DNA微陣列分析技術 DNA微陣列分析已被用在： １分析基因活性（表現）。科學家能決定出哪些 基因具有活性，比如說在一個特定的細胞，組 織或器官中，他們能找出基因表現的變化和物理 或生化過程的變化之間的關聯性，例如光合作用 在光波強弱不同的條件下的變化。 ２跟蹤基因體DNA的改變。許多實驗室利用DNA 微陣列分析技術來分析基因體DNA的改變。舉例 而言，分析發生在癌症細胞中DNA的改變。 30

重組DNA技術的應用 31

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