Microorganisms Producing Microbial Drug Chapter 1 Microorganisms Producing Microbial Drug

Section 1 Microorganisms Producing Microbial Drug 微生物是生物活性物质的丰富资源 微生物药物产生菌的来源 ? 交流、购买 从自然界中分离

表1 来源于土壤微生物的抗生素种属 及其数量 放线菌 真菌 细菌 已知的属 34 2000 97 已知的种 600 49000 300 表1 来源于土壤微生物的抗生素种属 及其数量 放线菌 真菌 细菌 已知的属 34 2000 97 已知的种 600 49000 300 已筛选的属 15 200 16

1. Actinomycetes (1) Streptomyces colonies 来自放线菌的微生物药物90-95%来源于链霉菌。 aerial mycelium and spores

(2) Rare actinomycetes Rare actinomycetes(稀有放线菌): 除链霉菌属外的其他属的放线菌。 产生庆大霉素 链轮丝菌(Streptoverticillium) 链孢囊菌(Streptosporangmm) 游动放线菌(Actinoplanes) 诺卡氏菌（Nocardia ） 糖多孢菌(Saccharopolyspora) 小单孢菌 Micromonospora

表2 稀有放线菌产生的抗生素 小 单 孢 菌 马 杜 拉 放 线 菌 游 动 孢 囊 链 霉 菌 诺 卡 氏 菌 氨基糖甙类 袢环大环内酯类 表2 稀有放线菌产生的抗生素 小 单 孢 菌 马 杜 拉 放 线 菌 游 动 孢 囊 链 霉 菌 诺 卡 氏 菌 氨基糖甙类 袢环大环内酯类 大环内酯类 肽类 蒽环类 缩酚肽类 多烯类 西伯利亚霉素 优胜霉素 普拉克托霉素 袢环大环 内酯类 氯霉素

2. Bacteria 芽孢杆菌 土壤中分离的荧光假单胞菌 细菌产生的抗生素： 杆菌肽、短杆菌肽、泰乐菌素、粘菌素、 多粘菌素E、多肽类等

粘细菌（Myxobacteria） 高等的原核生物 一类可滑行运动的单细胞革兰氏阴性菌 具有复杂的多细胞行为和形态发生 能产生非常丰富的次级代谢产物

Penicillium chrysogenum 3. Fungi 青霉素、头孢菌素、灰黄霉素、烟曲霉素、宛氏菌素、梭链孢酸、干蠕孢菌素、黄青霉素 mold Penicillium chrysogenum

yeast 氨基酸 核酸 免疫增强剂 Basidiomycetes（担子菌） Endohype(内生真菌) 紫杉醇Taxol

原核微生物 真核微生物 真菌 放线菌 假单胞菌 真细菌 青霉属曲霉属 链霉菌属 稀有放线菌 棒状杆菌 芽孢杆菌   真菌 放线菌 假单胞菌 真细菌 青霉属曲霉属 链霉菌属 稀有放线菌 棒状杆菌 芽孢杆菌 β-内酰胺类 氨基糖甙类 氯霉素 粘菌素 甾体类 氯霉素 大环内酯类 环丝氨酸 环丝氨酸 氨基糖甙类 β-内酰胺类 林可霉素 大环内酯类 新生霉素 产生微生物药物的不同种属微生物

Isolation of producing strains Section 2 Isolation of producing strains Active strain

Isolating Actinomycetes 微生物资源分布 土壤、水、空气、动植物及其腐败残骸都是微生物的主要栖居和生长繁殖场所 ？ Isolating Actinomycetes

I. 含微生物样品的标本采集 1. 从土壤中采样 了解每克土壤微生物的递减规律： 细菌(108) > 放线菌(107) > 霉菌(106) > 酵母菌(105) > 藻类(104)> 原生动物(103) 了解土壤特点： 土壤有机质含量、水分和通气状况 土壤酸碱度和植被状况 地理条件 季节条件

2. 从海洋采样 海洋的特点： 高盐度、高压力、低温、不同的光照条件，使海洋微生物具备特殊的生理活性 20％-50％的海鞘、海参体内的微生物可产生具有细菌毒性和杀菌活性的化合物 深海鱼肠道内的嗜压古细菌，80％以上的菌株 可以生产EPA和DHA

3. 从极端环境采样 高温、低温、高酸、高碱、高盐、高辐射强度的环境下存在的微生物——极端微生物 嗜热菌（thermophiles） 嗜冷菌 (psychrophiles) 嗜碱菌 (basophiles) 嗜酸菌（acidophiled） 嗜盐菌 （halophiles）

表3 极端环境放线菌产生的次生代谢产物 微 生 物 产 物 嗜冷链霉菌属 抗生素SP351 嗜热链霉菌属 表3 极端环境放线菌产生的次生代谢产物 微 生 物 产 物 嗜冷链霉菌属 抗生素SP351 嗜热链霉菌属 榴菌酸(granticinic acid) 嗜高温放线菌 嗜温红菌素 耐高温披发糖多孢菌(Saccharopolyspora hirsute) sporaricin 海洋链霉菌属 aplasmomycin 耐高渗链霉菌属 未鉴别抗生素 嗜碱链霉菌属 各种抗生素包括某些未鉴别抗生素

4.根据微生物生理特点采样 5. 从特殊环境采样 根据微生物营养类型 根据微生物的生理特性 分解酶产生菌 降解菌 5. 从特殊环境采样 得克萨斯州中南部的一个岩洞中存在着大量嗜碱性、能进行氨氧化和产几丁质酶的微生物. 侵蚀木船的一种蠕虫肠道中分离到既能固氮又能降解纤维素的微生物. 考拉(Koala)熊肠中分离到萜烯分解酶的产生菌.

II. 样品的预处理 对含微生物的样品预处理可大大提高菌种分离的效率。 物理法预处理 化学法预处理 诱饵法预处理

表4 含微生物材料的标本预处理方法（1） 方 法 处 理 材 料 分离出的菌株 物 理 方 法 55℃，6min 水、土壤、粪肥 表4 含微生物材料的标本预处理方法（1） 方 法 处 理 材 料 分离出的菌株 物 理 方 法 55℃，6min 水、土壤、粪肥 嗜粪红球菌(Rhodoccus coprophilus)、 小单孢菌属等 100℃，1h；40℃2-6h 土壤、 根土 链霉菌属、马杜拉菌属、小双孢菌属等 膜过滤法 水 小单孢菌属、内孢高温放线菌等 离心法 海水、 污泥 链霉菌属 搅动法 发霉的稻草 嗜热放线菌等

表4 含微生物材料的标本预处理方法（2） 处 理 材 料 分离出的菌株 方 法 利用某些稀放 生长需要的特殊 物质 化 学 方 法 表4 含微生物材料的标本预处理方法（2） 方 法 处 理 材 料 分离出的菌株 化 学 方 法 1％几丁质培养基 土壤 链霉菌属 高pH的CaCO3培养基 SDS-酵母膏 放线菌 NaOH处理 诺卡氏菌、小单孢菌 酚处理 链霉菌、小单孢菌 诱 饵 涂石蜡的棒 诺卡氏菌 花粉 游动放线菌属 蛇皮 小瓶菌属 人的头发 角质菌属 利用某些稀放 生长需要的特殊 物质

III. 含微生物样品的富集培养 Enrichment culture 富集培养: 在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种。 富集培养 基的选择 是相对的 方法: 控制培养基的营养成分 控制培养条件 施加选择性压力

控制培养基的营养成分 培 养 基 占 优 势 的 分 离 菌 株 几丁质琼脂培养基(含有胶态几丁质、矿物盐) 链霉菌属、微单孢菌属 培 养 基 占 优 势 的 分 离 菌 株 几丁质琼脂培养基(含有胶态几丁质、矿物盐) 链霉菌属、微单孢菌属 淀粉酪素培养基(含有淀粉、酪素、矿物盐) 基质减半的营养琼脂培养基 嗜热放线菌 葡萄糖-天冬酰胺培养基(含有葡萄糖、天冬酰胺、矿物盐土壤浸液、维生素) 马杜拉放线菌、小双孢菌、链孢囊菌 M3培养基(含有矿物盐、丙酸盐、硫胺素) 小单孢菌属、红球菌 AV琼脂培养基 诺卡氏菌属

控制培养条件 对pH、温度、通气量等条件加以控制培养达到有效的分离目的。 如 细菌、放线菌: 偏碱 pH7.0-7.5

施加选择性压力 通过高温、高压、加入抗生素等方法减少非目的微生物的数量，达到富集目的微生物的目的。 样品处理的选择性压力： 分离芽孢杆菌 土样加热到80℃/50％乙醇溶液浸泡1h 分离革兰阴性菌 适量的胆盐和十二烷基磺酸钠 分离厌氧菌 少量硫乙醇酸钠作为还原剂

表5 分离不同微生物时常用的抗生素或试剂 抗 生 素 或 试 剂 欲 分 离 菌 种 受抑制的微生物 一般细菌 表5 分离不同微生物时常用的抗生素或试剂 欲 分 离 菌 种 抗 生 素 或 试 剂 受抑制的微生物 一般细菌 放线菌酮、杀真菌素、抗滴虫霉素、优洛制霉素 霉菌、酵母 革兰氏阳性菌 原虫霉素、嘌吟霉素 原生动物 节杆菌 多黏菌素B 革兰氏阴性菌 放线菌酮 肠内细菌 青霉素、硫酸化烷盐 沙门氏菌 胆汁酸 大肠杆菌 拟杆菌 结晶紫   硝化细菌 小单孢菌属 庆大霉素 链霉菌属 诺卡氏菌属 土霉素、竹桃霉素 普通高温放线菌 制霉菌素、亚胺环己酮 真菌 马杜拉放线菌 亚胺环己酮、新生霉素、变红霉素、链霉素、棕霉素 细菌、霉菌

菌种分离纯化和活性筛选的一般步骤 标本采集 富集培养 分离纯化 初筛和 活性菌株筛选 复筛 菌种保藏 标本材料的预处理 目的菌株 获得单个菌落 1．稀释分离法 2．平板划线分离法 3．组织分离法 分离纯化 初筛和 复筛 活性菌株筛选 目的菌株 菌种保藏

Screening for activities Section 3  Screening for activities

I. 初筛 初筛：从大量分离到的微生物中将具有合成目的产物的活性菌株筛选出来的过程。 经济 简便 快速

1. 摇瓶发酵初筛 1菌株1摇瓶 摇瓶发酵法是将待测菌株的单菌落分别接种到三角瓶培养液中，振荡培养，然后，再对培养液进行分析测定。 1. 摇瓶发酵初筛 1菌株1摇瓶 摇瓶发酵法是将待测菌株的单菌落分别接种到三角瓶培养液中，振荡培养，然后，再对培养液进行分析测定。 特点：培养条件与生产培养条件相接近， 但工作量大、时间长、操作复杂。

利用细胞和动物病态模型直接筛选生理活性物质 肿瘤细胞模型 抗菌活性筛选 利用细胞和动物病态模型直接筛选生理活性物质 肿瘤细胞模型 荷瘤鼠模型 高血压动物模型 利用生化反应间接筛选生理活性物质 呈色反应 抑制酶活性

2. 琼脂平板筛选 平皿快速检测 平皿快速检测法是利用菌体在特定固体培养基平板上的生理生化反应，将肉眼观察不到的产量性状转化成可见的“形态”变化。 特点： 操作简便、速度快，固体培养条件和液体培养条件之间有差异。  

定性或半定量用 大大提高筛选的效率 固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分，造成不透明的培养基背景。菌落利用此物质形成透明圈。 饱浸含某种指示剂的固体培养基的滤纸片变色圈 待筛选的菌株能分泌产生某些能抑制工具菌生长的物质 指示剂直接掺入或喷洒固体培养基，菌落周围形成变色圈。如淀粉的平皿上喷上稀碘液 利用一些有特别营养要求的微生物作为工具菌，如待筛选菌具有该营养物的前体转化成营养物 能力，目的菌就能围绕该菌生长 定性或半定量用 大大提高筛选的效率

表6 筛选抗生素的常用试验菌 敏 感 菌 株 代表的微生物类型 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus G+球菌 表6 筛选抗生素的常用试验菌 敏 感 菌 株 代表的微生物类型 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus G+球菌 枯草杆菌 Bacillus subtilis G+杆菌 大肠杆菌 Escherichia coli G-肠道菌 草分枝杆菌 Mycobacterium phlei 结核分枝杆菌 酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae 白假丝酵母 Candida albicans 酵母状真菌 灰棕黄青霉 Penicillium griseofulvum 黑曲霉 Aspergillum niger 丝状真菌

II. 复筛 1菌株3-5个摇瓶 摇瓶发酵复筛 菌株的复筛 活性的复筛