亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与乳腺癌新辅助化疗敏感性关系的研究探讨 季明华 唐金海 江苏省肿瘤医院乳腺科

乳腺癌（breast cancer)是女性最常见的恶性肿瘤，近年来乳腺癌的发病率呈现着上升趋势。据统计目前全世界每年死于乳腺癌的病例约为41万人，约占女性全部癌症死亡病例的14% ，居女性癌症死因的首位或第二位。

◆ 研究目的和意义 ■目的：研究亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）基因 C677T、A1298C多态与乳腺癌患者对新辅助 化疗敏感性的关系。 ■意义：寻找可靠的预测指标指导个体化治疗, 从而 为进一步实现乳腺癌规范化综合治疗提供参 考依据。

◆ 研究对象 恶性证据 术后病理 可测量病灶 新辅助化疗 2008年1月至2009年4月 在江苏省肿瘤医院就诊 的61例乳腺癌患者 ※ 为2006年1月至2007年4月江苏省肿瘤医院就诊的并行新辅助化疗的乳腺癌患者，共61例； ※ 术前均取得病理学/细胞学示恶性的证据； ※ 均经临床或影像学检查证实有可测量病灶； ※ 化疗前各项常规检查均未显示化疗禁忌； ※ 术后常规行病理学检查，检测化疗反应的程度。 可测量病灶 新辅助化疗

◆ 评定标准 ▲ 化疗疗效的评定标准： 以CR和PR为有效 参照WHO实体瘤疗效评定标准 分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、无变化(SD)和进展(PD)。 以CR和PR为有效

▲ 化疗后病理反应分级标准 0级： 癌细胞没有变化； I级： 癌细胞有轻度变化或有显著变化但＜2/3的 范围 II级 癌细胞显著变化达2/3或以上 III级 癌细胞完全消失或坏死，被肉芽组织和(或) 纤维组织替代 把I～III级定为病理有反应！

◆ 实验技术路线 ★ 白细胞层DNA提取步骤 ● MTHFR C677T 多态性检测方法 ● 结果判断 ◆ 实验技术路线 ★ 白细胞层DNA提取步骤 ● MTHFR C677T 多态性检测方法 ● 结果判断 ● Hinf I酶切MTHFR 677基因DNA片段产物电泳图 ▲ MTHFR A1298C多态性检测方法 ▲ 结果判断 ▲ Mbo Ⅱ酶切MTHFR A1298C基因DNA片段产物电泳图

● MTHFR C677T基因多态性检测方法 §试剂: §仪器: 4×dNTPs（宝生物工程(大连)有限公司)) 引物（宝生物工程(大连)有限公司) Taq 酶(北京博瑞科技有限公司) 限制性内切酶Hinf I(宝生物工程(大连)有限公司) 10×Buffer(宝生物工程(大连)有限公司) §仪器: PCR 扩增仪两台(美国MJ公司，德国Biometra公司) 冷冻高速离心机(0～16000r/min) (德国Eppendorf公司) 可调式移液器(0～2µl, 0～100µl, 0～1000µl)(GILSON公司)

PCR扩增MTHFR 677基因片段 (198bp) MTHFR 677基因型检测 （Hinf I酶切PCR扩增产物） 结果判断

● 结果判断 1）当为677C/C基因型时， PCR产物不能被限制性内切酶Hinf I 酶所识别，PCR产物则不能被消化，琼脂糖凝胶上表现为198bp片段，可清晰见到198bp一条亮带。 2）当为677T/T基因型时，PCR产物被限制性内切酶Hinf I酶消化后可产生175bp、23bp二个新的片段。其中23 bp的片段由于太短而无法在凝胶上清楚的显示，故琼脂糖凝胶上只可清晰的见到175bp一条亮带。 3）当为677C/T基因型时，可产生198bp、175bp、和23bp三个片段。其中23bp的片段由于太短而在凝胶上无法清楚显示，故琼脂糖凝胶上只清晰见到198bp和175bp两条亮带。

● Hinf I酶切MTHFR 677基因DNA 片段产物电泳图 lane 1: Maker; lane 2: C/C genotype; lane 3: C/T genotype; lane 4: T/T genotype. 198bp 175bp

▲ MTHFR A1298C基因多态性检测方法 §试剂: §仪器: 4×dNTPs（宝生物工程(大连)有限公司)) 引物（宝生物工程(大连)有限公司) Taq 酶(北京博瑞科技有限公司) 限制性内切酶Mbo Ⅱ（宝生物工程(大连)有限公司) 10×Buffer(宝生物工程(大连)有限公司) §仪器: PCR 扩增仪两台(美国MJ公司，德国Biometra公司) 冷冻高速离心机(0～16000r/min) (德国Eppendorf公司) 可调式移液器(0～2µl, 0～100µl, 0～1000µl)(GILSON公司)

PCR扩增MTHFR A1298C基因片段 (84bp) MTHFR A1298C基因型检测 （MboⅡ酶切PCR扩增产物） 结果判断

▲ 结果判断 1）当为1298A/A基因型时，PCR产物被限制性内切酶Mbo Ⅱ消化后可产生56bp、28bp二个新的片段。其中28bp的片段由于太短而在凝胶上无法清楚显示，故琼脂糖凝胶上只可清晰见到56bp一条亮带。 2）当为1298A/C基因型时，可产生84bp、56bp、和28bp三个片段。其中28bp的片段由于太短而在凝胶上无法清楚显示，故琼脂糖凝胶上只可清晰见到84bp和56bp两条亮带。

▲ Mbo Ⅱ酶切MTHFR A1298C基因 DNA片段产物电泳图 lane 1: Maker; lane 2: Product of PCR； lane 3: A/A genotype; lane 4: A/C genotype. 84bp 56bp

● MTHFR基因型和新辅助化疗疗效的关系(表1） Genetype C677T A1298C type T/T C/T C/C A/A A/C n 18 29 14 44 17 Effects of chemotherapy X2 P CR+PR(%) SD+PD(%) 15(83.3) 3(16.7) 21(72.4) 8(27.6) 6(42.9) 8(57.1) 31(70.5) 13(29.5) 11(64.7) 6(35.3) 0 0 0.72 0.40 5.54 0.02 0.19 0.67 下面来看一下我们统计的一些数据。

● MTHFR基因型与乳腺癌新辅助化疗病理反应率 的关系（表2） Genetype C677T A1298C type T/T C/T C/C A/A A/C n 18 29 14 44 17 reaction rate of chemotherapy X2 P 0(%) Ⅰ－Ⅲ(%) 3(16.7) 15(83.3) 10(34.5) 19(65.5) 9(64.3) 5(35.7) 13(29.5) 31(70.5) 9(52.9) 8(47.1) 0 0 1.72 0.19 7.38 0.01 2.86 0.09 根据以上结果我们可以得出一个结论：MTHFR C677T基因多态性的作用与乳腺癌新辅助化疗敏感性之间存在着一定的相关性。

一.MTHFR基因多态性与化疗敏感性之间有何关系？ 同型半光氨酸 5,10-MTHF 甲基供体 蛋氨酸合成酶 MTHFR DNA的低 甲基化 蛋 氨 酸 genovariation MTHFR 5－MTHF DNA修复 能力降低 s-腺苷蛋氨酸 化疗敏感 性的变化 DNA的甲基化

insignificant differences significant differences 二.本研究的结果得出的结论？ MTHFR 677 C／T 患者的化疗疗效 MTHFR 677 C／T I～III级化疗反应率 50.0<P insignificant differences 50.0<P MTHFR C677T基因多态 与乳腺癌新辅助化疗敏感性之间 存在着一定的相关性 MTHFR 677 T／T 患者的化疗疗效 MTHFR 677 T／T I～III级化疗反应率 P<0.05 significant differences P<0.05 MTHFR 677 C／C 患者的化疗疗效 MTHFR 677 C／C I～III级化疗反应率

insignificant differences MTHFR 1298A/C 患者的化疗疗效 MTHFR 1298A/C I～III级化疗反应率 50.0<P 50.0<P insignificant differences MTHFR A1298C基因多态 与乳腺癌新辅助化疗敏感性之间 相关性不明显 MTHFR 1298A/A 患者的化疗疗效 MTHFR 1298A/A I～III级化疗反应率 有文献报道1298基因多态对细胞内叶酸分布的影响明显低于677基因多态, 故 1298基因多态对化疗敏感性的影响同样低于677基因多态，本研究结果亦然。 [Vander Put NM, Gab reels F, Stevens EM, et al. A second common Mutation in the methylenetetrahydrololate reductase gene: an additional risk factor for neural-tube defects[J]. Am J Hum Genet,2005,62(2):1044-1051. ] 我们可以把1298基因多态的作用作为预测乳腺癌新辅助化疗敏感性的一个参考指标。